《细胞因子在慢性病毒性心肌炎心肌纤维作用及清心Ⅱ号的干预作用》由会员分享，可在线阅读，更多相关《细胞因子在慢性病毒性心肌炎心肌纤维作用及清心Ⅱ号的干预作用（11页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 窦丽萍 徐百鸿 王娟 程志清 作者单位：浙江中医药大学 杭州 310053【摘要】 目的探讨 TGF1 在反复病毒感染致慢性病毒性心肌炎心肌纤维化对纤维连接蛋白及其受体整合素 1 表达的影响与清心号干预作用。 方法建立病毒性心肌炎慢性期心肌纤维化模型后小鼠随机分为模型组、卡托普利治疗组、清心号高、中、低治疗组,正常组和模型组给予生理盐水灌胃,治疗组分别给予卡托普利和清心号高中低剂量灌胃。疗程结束后分别采集心脏,应用 RT-PCR 技术检测 CVB3-RNA；免疫组化技术检测 TGF1 和 FN;免疫荧光染色-共激焦扫描分析整合素 1。 结果造模后 TG
2、F1、整合素 1、FN 明显增高，应用 RT-PCR 在心肌中可检测出病毒，清心号干预后 TGF1、整合素 1、FN 减低，各治疗组病毒减少。结论病毒、TGF1、整合素 1 及 FN 在心肌纤维化形成中具有重要作用，清心号具有抗病毒、抗心肌纤维化作用。【关键词】 整合素 1；清心号；心肌炎；心肌纤维；TGF1;纤维连接蛋白;免疫组化；激光共聚焦基金项目：浙江省自然科学基金资助计划项目（No:Y207808）KKME-专业医学搜索引擎 http:/ project:Item supported by Zhejiang Provincial Natural Scientific Foundatio
3、n（No:Y207808）The Effect of Cytokine on Myocardial Fibrosis of Chronic Viral Myocarditis and the Interventional Treatment of QingXinLiu Wang，Dou Liping，Xu Baihong，et alZhejiang University of Traditional Chinese Medicine，Hangzhou(310053)Abstract:ObjectiveTo study the effect of TGF1 on the expression o
4、f fibronectin and 1 integrin receptor in chronic viral myocarditis of myocardial fibrosis induced by repeated virus infection and the interventional effect of QingXin.Methods Establish mice model of myocardial fibrosis in chronic stage of viralmyocarditis,then divide the mice model into model group，
5、captopril group，QingXin high dose,medium dose and low dose groups.The normal group and model group are given saline through stomach perfusing，as well as the treated group are given respectively captopril and QingXin high,medium and low dose in the same way.After the treatment，hearts are collected，CV
6、B3- RNA are detected by RT-PCR，TGF1 and FN are detected by immunohistochemical technique，integrin1 are analyzed by immunofluorescence staining-confocal laser scanning.Results After having done the model，TGF1,integrin1,FN has increased obviously；virus can be KKME-专业医学搜索引擎 http:/ in themyocardium by R
7、T-PCR；after the intervention of QingXin，TGF1,integrin1,FN has decreased，virus has reduced in treated group.Conclusion Virus，TGF1，integrin1 and FN have important effects on the formation ofmyocardial fibrosis；QingXin has the function of antivirus and anti-myocardial fibrosis.Key words:integrin 1；Qing
8、Xin ;myocarditis;myocardial fibrosis;TGF1;fibronectin；immuno-hischemical technique；confocal laser scanning病毒性心肌炎慢性期的主要病理特征为心脏间质纤维化,临床病理表现为心脏顺应性下降,僵硬度增加,进而引起舒张功能障碍,可发展为 DCM,同时也是顽固性心律失常、慢性心功能不全难以逆转、猝死的重要原因之一。由于病毒的持续存在，心肌不断损伤，最终导致心肌纤维化，但具体机制欠清，本实验从细胞因子角度阐述纤维化形成机理并进一步阐明清心号抗心肌纤维化的机制。1 材料及方法1.1 实验动物健康雄性 B
9、alb/c 小鼠，体重 1416g，购自中科院上海实验动物中心，浙江中医药大学动物实验中心饲养，动物质量合格证号:SCXK(沪)2003-0003，饲养于清洁动物房内，动物饲养设施条件合格证：SYXK(浙)2003-0003。KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 实验病毒及药物柯萨奇 B3 病毒(CVB3)(Nancy 株,TCID50=10-7),由复旦大学附属中山医院病毒性心肌病重点实验室提供,本实验室-70低温冰箱保存。清心号(人参、丹参、苦参组成),水煎醇提，喷雾干燥，浙江中医药大学药学院制剂室提供。1.3 试剂免疫组化检测试剂盒 EnVisionTM Two-Step Histo
10、staining Reagent Lot:00002568101，丹麦 DAKO 公司产品；TGF-1 为Rabbit 来源的多克隆抗体 Lot:8923100，工作浓度均 1：50，武汉博士德生物公司产品；Fibronectin 为 Mouse 来源单克隆抗体，Labvision NeoMarkers 公司产品；整合素 1 为美国 BD 公司的产品，Rabbit 来源的多克隆抗体，工作浓度均 1：75） ；引物：上海 Sangon生物工程技术公司合成，序列如下：coxsackie,上游TAACACACACCGATCAACAG,下游ATGGCCAATCCAATAACTAT,扩增产物大小为 52
11、2bp;GAPDH,上游GAGGCCGGTGCTGAGTATGT,下游CTTCTGGGTGGCAGTGATGG,扩增产物大小为 294bp；PCR 试剂购于大连宝生物工程有限公司。2 方法2.1 动物模型的制备及分组健康、雄性 Balb/c 小鼠 200 只，习惯性饲养 2d 后，参照文献1-2成功造模方法及预试验结果，随机分出正常对照组 10 只，KKME-专业医学搜索引擎 http:/ Eagle，s 液，接种日期及次数同以下各组，其余首次腹腔接种内含 CVB3TCID50=10-5 的 1：2000 病毒稀释液0.2ml只后常规饲养，14 天腹腔接种 1：1600 浓度 CVB3 病毒液
12、0.2rnl只，28 天后腹腔注射 1：800 浓度 CVB3 病毒液 0.2rnl只，60 天后成活小鼠为病毒性心肌炎慢性期心肌纤维化模型。随机选取78 只，并随机分为 5 组：模型组 10 只、卡托普利组和清心号高剂量组、中剂量组、低剂量组分别为 17 只。造模 2 个月后，清心号治疗组分别按高、中、低剂量灌胃，卡托普利治疗组按 45mg/kg灌胃，模型对照组、正常对照组给予等量生理盐水灌胃，每日 1 次,疗程为 45d。2.3 观察指标及检测方法2.3.1 动物的一般情况（精神状态、活动度、皮毛光泽度、皮温及死亡情况） 。2.3.2 心脏组织病理学观察：疗程结束后，小鼠活杀断头取心脏，右
13、心室和室间隔部，置于液氮中，用作 RT-PCR 实验的CVB3 基因检测；剩余部分心肌立即放在 10%中性缓冲福尔马林（pH7.4）固定液中固定，石蜡包埋后常规连续切片，厚4m，6062烘箱烤片后，做 HE 染色和 VG 特殊染色及免疫组化染色。2.3.3 TGF-1、Fibronectin 免疫组织化学的检测：石蜡切片脱蜡至水，抗原修复，3%双氧水阻断内源性过氧化物酶10min，PBS 洗，滴加一抗、二抗；37孵育 40min;DAB 显色KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 为 AEC 显色，阳性呈红色）,封片。以 PBS 代替一抗作空白对照。利用 HPIAS-1000 病理图文分析系
14、统半定量分析TGF1、Fibronectin 蛋白水平的表达，即对每张切片的心肌阳性细胞的着色强度采用 HPIAS-1000 病理图文分析系统进行测量。每张切片随机采集 5 个视野（200 倍） ，经过该系统自动分析分别获得该 5 个视野的 5 个平均值（分别为：平均光密度值、积分光密度值） ，经平均后代表该标本的染色强度，代表该蛋白的表达强度。2.3.4 整合素 1 免疫荧光染色-共激焦扫描：石蜡切片二甲苯脱蜡、乙醇梯度水化。抗原修复，滴加适当比例稀释的整合素1 一抗，37oC 孵育 1h；用 PBS 代替一抗为空白对照。PBS 冲洗，滴加山羊抗兔 IgG 抗体-荧光素 FITC 标记，0.
15、1%DAPI 液衬染；20%甘油封片剂封片；共激焦显微镜下观察扫描及照相，心肌细胞胞浆呈黄绿色为阳性，细胞核呈蓝色。应用 Leica 共激焦显微镜自带的分析程序进行图像分析，以整合素 1 像素值占总像素百分比作为整合素 1 的像素密度，即以整合素 1 像素密度代表整合素 1量的高低。2.3.5 CVB3RNA 的 RT-PCR 检测:总 RNA 抽提及鉴定、逆转录反应后聚合酶链反应:Eppendorf 管中依次加入 10Taq Buffer 缓冲液 5l,上下游引物各 2l,MgCl2(25mM)4L,Taq 酶(5U/l)0.5l，dNTP(2.5mM)4l，DEPC 水 30.5l。95预变性5min,94变性 25s,58退火 35s,72延伸 15s,终末延伸 7min，35 个循环，4保温。样本以基因 GAPDH 作为内参照，经 1.5%琼脂糖KKME-专业医学搜索引擎 http:/ EB）电泳，紫外光下拍照，电泳结果用 Syngene 成像分析系统（英国）进行扫描及灰度分析，对阳性电泳条带进行吸光度峰值下面积积分，以 coxsa
