《小鼠MTX抗性细胞系的蛋白质组学研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《小鼠MTX抗性细胞系的蛋白质组学研究（46页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、 哈尔滨医科大学硕 卜 学位论文中 文 摘 要氨甲蝶吟 ( m et ho trax at e ， MT x )是一 种临床常用 化疗药物，然而在抗肿瘤治疗中，持 续给药会导致细胞获 得耐药性， 使治疗效果不 佳。 在 M T X抗性细胞系中存在的双微体 ( d oubl e min ut es， D MS )与 MT X的耐药性密切相关。D Ms 是基因扩增的常见细胞遗传学结构 ，它的存在为细胞提供了一种选择性的生长优势。为寻找 D Ms 上携带的扩增基因以及与 MT x耐药相关的蛋白质，本研究以细胞系 3 T 3 R 5 00 ( 来源于小鼠胚胎成纤维细胞系 N IH3 T 3 且具有 M
2、T X抗性) 、M T X 3 0 0 ( 可耐受3 0 0 协 m o l / L M T X ) 和N I H 3 T 3 为 研究对象， 利用比 较蛋白 质组学的研究方法对其进行了研究。应用双向电泳技术分离上述 3 种细胞系的蛋白质组成分， 软件分析蛋白质组表达图 谱， 筛查到了6 个在M T X 3 00 中 表达显著高于3 T3R 5 00 和N IH3 T3 的蛋白 质点，将其胶内 酶切后利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱( m atri xa s s i s te d l a s e r d e s o rp t i o n i o n i z at i o n t i m e
3、 o f fl i ght ma s s s P e c t ro me t r )，M A L DI一 T O F 一 M S)成功了鉴定其中的 2个蛋白质，分别为二氢叶酸还原酶( d i h y d r o fo l at er e d uc t a s e ， D H F R ) 和 a p 一晶 体蛋白 ( a p 一 c 仔 s t a l l i n ) ，并利用wes l e rnbl ot对二者的表达情况进行了进一步的验证。以 上结 果提示D H F R和邓一 品体蛋白 与M T x的耐药密切相关。 已 有大量研究 表明 在 M T X抗性细 胞系中存在的 D M S上 携带有
4、 扩增的 D l l 石 ，R基因， 并且D 月 不 次基因的扩增导致蛋白量的增高是重要的MT x耐药机制之一。本研究从蛋白 质组学这样一个 全新的角度刘其进行了 进一步的印证。目 前仍未见 邓一晶体蛋白与M T x耐药关系的 相关报道，同 时， 邓一 晶体蛋白的过表达是否由 于其 编码基因CR 州B以D M、 为载体得到了扩增而导致其蛋白产物表达量的增高也有待进一步的研究。关键词:蛋白质组:D Ms :基因扩增:MT X杭性小鼠M T x 抗 性 细 胞 系 的 蛋白 质 组 学 研 究 _P rot eom i c A n a l y s i s for t h e l d e n t i
5、 介 c a t i o n ofP rote i n s 砒Ia te d toDMs a n dMT XRe s i s t a n c ei nMT X- r e s i s tan t Mo u s e Ce l l sAb s t r a C tM e t hotr e x ate( MT X )i so n eo f th em o s t i InPo r t a ntdr ugsfreq u e nt l yu s e di nther aPy ， b u t i t s e ffic i e n c y i s o ft e n c o m P r o m 1 s e d b
6、 y th e d e v e l o P m e nto f r e s i s t anc e inc anc e rc e l l s . I nMT X 一 r e s i s t antc e l l s ， t h eexi s te n c eo fd o u b l eml l l u t e s( D Ms) i s韶s o c i a t e d wi th u n st abl eMT X r e s i s t a n c e D Msa r ee x t r a c h r o n l o s o l l l a ace n l r i cfrag ment s wh
7、ichc o ntai n amP l i fi e d g e n e s a n d c o l fe r a s e l e c t i v e a d v ant眼e toc e l l sTo劝 ek 即di d 即t i fya m p l i fi e dgen es伪n t a 1 n e db yD Ms andP r o t e i n s r e l a t e dtoMT Xr e s i s t anc e ，c e l ll i n e3 T 3 R S O O ( d e r i v e dfr o rn i t sP aren t a c e l ll i n
8、eN I H 3 T 3 ) 、M T X 3 0 O (res i s t ant toM T Xo f 3 O OPlllo lj L ) and N I H 3 T 3 w e r e u s e d fo r c o mPa r a t i v eP ro t e o m i c ana l y s i sP r otei n so fth e t hre e c e l ll i n e s a b o v e 一 m e n t i o n e d w e r e s ePar ated b y认 阳一 d i m e n s i o n a l e l e c t r o p h
9、ore s i s ( 2 一 D E ) . A ft e r c o m p ut e r ana l y s i s o f the P ro t e o m ee x p r e s s i o nm a P s ， w e w e r e a b l e t od e t e c t s i xP r o t e 1 ns P o t s W i t hre m a r k a b 1 yh i ghe re x Pre s s i o ni nMJ X3 0 0c e l l l i n e t h a n3 T 3 R 5 0 0 a n d N I H 3 T 3， and t
10、 wo o f th e mw e r es u c c e s ful yi d e n t i fi e da s d i h y d rofol a t e r e d u c t a s e ( D H F R ) a n da p 一 c r y s t al l i nv i a l n a t r l x韶s i s t e d王 a s e rd e s o 单t l o ni o n i z a t i o nt l l l l en i g h tr e v e a l e dby1 1 、 为9 又ofs p e c t r o m e t r y ( MA L D I
11、一 T O F 一 MS ) ana l y s i s . To c o n 五 r mt h efi n d i n g s2 一 DEg e l a n a l y s i s and MS ， We st e r n b 1 o t t 1 n g o n t h e t w o P ro t e ln s w a s p e r fo r m e d .The r e s u l t s s u g g e s t e d t h a 吐 D H F Ra n d a p 一 c r y s t a l l i n m ayp l 叮a n i m P o r t a n t rol
12、 e i nth e M飞 Xr e s i st a n eem e c h ani s mExte n s i v e s t 司i e s h ave r e v e a 三 e d th ata n 、 P l i fi e d D 乃 毕 Rg e n e sa r ec o n t a i n e db yD Msi nMT X 一 r e s i s t a n t c e l l l i n e ， a n dth eamP l i fi c at i o no fD Z IFRgen e l s o n e o f t h e n 飞 o s t i l 们 p o rt a
13、nt m c c h a n i s m s o f MT Xr e s i s t a n c e ， w h i chwasfu rt h e r c o n fi r m e d b y t h e P r e s e n t r e s e a r c h fr o ma b r and 一 n e wa n g l e b y u s i n g p ro te o m i ca n a l y s i s .T h e r e fo r e ，a d d i t i o n a ls t u d i e ss h o u l dh e l Pd e t e r m i n et h
14、 efu n c t i o no fa p 一 c r y s t a l l i ninM I 、X r e s i s ta n c cm e c h a n i s m a n dwet h e rth eo v e rexP r e s s i o nof哈尔滨医科大学硕 土 : 学位论文a p 一 c ry s t a l l ini s o w i n g tot h e amP l i fi c at i o no f i t s c o d i ng g e n e CRYABc o nt a 1 n e d 勿DM S .K c 邓于 o r d s : P r o t e
15、 o m e ;D Ms ;G e n e a m P l i fi c at i o n ;MT Xre s i s t anc e_ _ 小鼠M T x 抗 性 细 胞 系 的 蛋白 质 组学 研 卜 究_前言M T X是一种细胞周期特异性的 抗 代谢药， 在肿瘤的临床治 疗中，是一种常用的化疗药物。 然而， 连续用药通常会产生 M I X 抗性，造成 化疗失败。在M T X抗性细胞系中，经常可以发现 D M s ， 其存在及其携带的扩增 基因与 MT X的耐药性密切相关。 D Ms 是细胞中环状成对、 可自主复制的额外染色 体成分，经常含有扩增的基因。 D M s的产生及其携带的 扩 增
16、基因，是导致癌基因表达增加的重要基因组改变，同时也是肿瘤细胞抗药性现象的一个重要细胞遗传学基础。特定基因 拷贝 数的增加， 可为在细胞毒性药物中生长的细胞提供一种选择性的生长优势。在抗性细胞中经常发现位于D M s 上的与肿瘤细胞抗药性相关的基因的扩增。特定基因的扩增将会导致其最终表达产物 蛋白质的大量积累。 作为基因产物的蛋白 质是生命活动的主要承担者、 执行者， 因此， 本研究从蛋白 质组水平着手， 利用比 较蛋白 质组学的分析方法， 寻找并鉴定小鼠MT X抗性细胞中显著高表达的蛋白质，从而为 MT X的耐药机制和 D Ms 的作用机制提供线索。哈尔滨医科大学硕 卜 学位论文文献综述一、基因扩增基因扩增是指细胞获得基因组某一部分的额外拷贝导致基因拷贝数大量增加的现象，它是染色体扩增的本质， 是细胞在短期内为满足某中需要而产生足够基因产物的一种调控手段。在某些低等真核生物在特定发 育阶 段， 通过特定基因簇的染色体外 或原 位扩增来满足在短期中发育的需要，如 爪蟾卵 母细 胞和四 膜虫巨 核中
