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1、KKME-专业医学搜索引擎 http:/ RT - PCR 法检测膀胱移行细胞癌法检测膀胱移行细胞癌VEGF 的表达和意义的表达和意义作者：安全意,张金刚,刘德斌,李成,马可为 作者单位：1 014300 内蒙古鄂尔多斯，鄂尔多斯市达拉特旗公安局刑警大队 2 017000 内蒙古鄂尔多斯，鄂尔多斯市东胜区公安局刑警大队 3 010011 内蒙古呼和浩特，【摘要】目的 建立实时荧光定量逆转录-多聚酶链反应(real-time quantitative, RT-PCR)检测膀胱移行细胞癌(BTCC)组织VEGF mRNA 表达的方法,并验证其与免疫组织化学检测 VEGF 蛋白表达的相关性。方法 采
2、用免疫组织化学 SP 法和实时荧光定量 RT-PCR 法分别从蛋白水平和 mRNA 水平检测了 31 例 BTCC 和 15 例正常膀胱黏膜组织中 VEGF 的表达。结果 BTCC 中 VEGF mRNA 表达水平显著高于正常组，两组比较差异有显著性(P60%为强阳性(+)。1.3 实时荧光定量 RT-PCR 法1.3.1 试剂和仪器 试剂: Trizol 试剂(Gibco 公司,美国),逆转录酶 M-MLV (Promega 公司), Taq 酶(Sangon 公司), DEPC (Sigma 公司)，引物 荧光探针合成和 PCR 反应试剂盒(上海生工公司): VEGF上游引物序列为 5-A
3、TGAACTTTCTGCTGTCTTGG-3,下游引物序列为 5-TCACCG CCTCGGCTTGTCACA-3;-actin 上游引物序列为5-GATTGGAATCTGGCTACT-3,下游引物序列为 5-TAGGGCTGAAGACAGGG-3; 仪器：实时定量 PCR 仪(美国 MJ OPTICON-2)。1.3.2 RNA 提取和反转录 按照大连宝生物工程有限公司Trizol 总 RNA 提取试剂说明提取 RNA。用紫外分光光度计及琼脂糖凝胶电泳检提取到的 RNA 的完整性、纯度和含量。剩余 RNA 于-70保存备用。反转录前直接将 6.5l 的 RNA 加入到反转录体系中合成 cDN
4、A。反应体系为 10l，其中 PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5l(TaKaRa DRR037S)、5PrimeScript Buffer 2l、Random 6mers(引物)0.5l、Oligo dT Primer(引物)0.5l。于 PCR 仪进行反转录，反应条件为：3715min，85 5s。1.3.3 实时定量 PCR 采用 SYBR Green I 荧光染料法进行实时定量 PCR 扩增的检测。PCR 反应体系为 20l，其中2SYBRpremixEXTaq TM10l(TaKaRa DRR041A)、上下游引物各0.4l(10mol/L)、cDNA 2l
5、、dH2O 7.2l。于实时定量 PCR 仪KKME-专业医学搜索引擎 http:/ MJ OPTICON-2)分别进行 VEGF 和 -actin 的 PCR 反应，扩增条件为：95预变性 30s;95变性 10s，58退火 15s，72延伸10s，45 个循环后，72延伸 10min。反应过程中同时设阳性对照，以水替代 cDNA 为阴性对照。VEGF mRNA 相对表达量采用 2-CT进行计算,CT=CTVEGF-CT-actin。1.3.4 PCR 扩增产物特异性的确定 PCR 产物经单一熔解曲线峰进行确定，并取 5l PCR 产物经 2%琼脂糖凝胶电泳(100V，15min)确定扩增产
6、物片段大小后，送交上海生工进行序列测定。1.4 统计学分析 应用 SPSS 11.0 统计软件采用 2 检验及相关性分析,P0.05 为差异有显著性统计免疫组化结果;采用进行单因子方差分析 P0.05 为差异有显著性统计荧光定量 PCR 结果。2 结果2.1 免疫组化结果2.1.1 BTCC 组与正常对照组的关系 VEGF 的阳性染色主要位于癌细胞胞浆内,呈弥散性分布,部分间质细胞也有表达(见图 13)。在正常膀胱黏膜细胞中均不表达或低表达,而在 BTCC 中阳性表达率分别为 100%。两组比较差异有显著性(P0.05)(如图 13，表 1)。表 1 BTCC 组与正常对照组 VEGF 的表达
7、 注：BTCC 组与正常对照组比较差异有显著性(P0.05)2.1.2 VEGF 表达与病理分级、临床分期的关系 VEGF 分别在 BTCC 的病理分级和临床分期中表达的差异均有显著性(P0.05,见KKME-专业医学搜索引擎 http:/ 2)。表 2 VEGF 在 BTCC 病理分级及临床分期中的阳性表达注：G2、G3 与 G1 比较有统计学意义(P0.05), T2-T4 与 Tis-T1 比较有统计学意义(P0.05)2.2 实时荧光定量 PCR 结果 实时定量 PCR 检测 BTCC 组和正常对照组 VEGF 的 mRNA 的变化(见图 4)。3 讨论VEGF 是一种由肿瘤细胞分泌的
8、二聚体多肽,相对分子量为3445KD,基因定位于 6P21.3,有 5 种分子变异体6。一些直接、间接的证据已经证明肿瘤生长是血管依赖的7。与大多数实体的恶性肿瘤一样, BTCC 的发生发展依赖血管生成8。肿瘤进展过程中肿瘤组织可分泌多种因子和多种蛋白水解酶类,特别是 VEGF 转移到内皮细胞和血管基底膜表面,以促进内皮细胞分裂,增加毛细血管的通透性,利于内皮细胞的增殖和迁移,促进肿瘤新生血管的形成。同时 VEGF 还能促进内皮细胞和恶性肿瘤细胞表达整合素,以利用肿瘤细胞的迁移、黏附和浸润9。BTCC 的分级越高,细胞的分化水平就越低,细胞的生长就越活跃,这可能是在肿瘤组织和患者的血液研究中,
9、都得出随着肿瘤的病理学分级的升高,组织和血液中的 VEGF 含量都逐步升高的原因,浸润性肿瘤的细胞生长当然比浅表性肿瘤的细胞生长要活跃,可见,浸润性肿瘤的细胞 VEGF 的含量当然要比浅表性肿瘤细胞 VEGF 的含量高。免疫组化研究发现正常组织中 87%无 VEGF 阳性表达,而 31例 BTCC 组织中 VEGF 阳性表达为 100%，且随着病理级别的增高,VEGF 阳性信号明显加强,进一步表明了 VEGF 蛋白在 BTCC 中的表KKME-专业医学搜索引擎 http:/ BTCC 细胞的分化程度有关系,在浸润癌中 VEGF 的阳性信号明显高于浅表癌,提示 VEGF 表达与膀胱癌细胞的浸润能
10、力有关。实时 RT-PCR 是一种能精确测定基因 mRNA 表达水平的荧光检测系统,在每一个 RT-PCR 循环的延伸阶段,基因产物都有一次定量检测,这种新方法和传统 RT-PCR 相比有很多优点。本研究采用实时 RT-PCR 定量方法进行 BTCC 组织 VEGF mRNA 定量分析,结果显示, BTCC 组织中 VEGF mRNA 表达水平明显高于正常组织(P0.05)。VEGF 转录水平升高,提示肿瘤细胞可能合成或分泌更多的 VEGF 蛋白,但由于基因转录翻译过程会受到多种因素的影响,基因转录水平和组织蛋白水平可能会出现不一致性,既往有研究者的实验曾得出阴性结论,分析发现这些研究者多采用
11、人为染色强度等级判断的方法进行蛋白水平比较分析,难以区分染色程度接近切片之间的表达强弱,而彩色病理分析系统从一定程度上解决了这个问题,增强了敏感性。本实验采用该方法进行半定量分析结果显示, VEGF 蛋白表达水平在BTCC 组和正常对照组中的分布特点与 VEGF mRNA 表达完全一致,并呈正相关关系,提示 VEGF 与 BTCC 的发生和生长密切相关系。综上所述,本研究建立的用于检测人 BTCC 的 VEGF mRNA 的表达的实时荧光定量 RT-PCR 方法,是一种快速有效、灵敏度高、特异性好的定量检测方法,与免疫组化 SP 方法检测的 VEGF 蛋白表达具有良好相关性, VEGF 与 B
12、TCC 病理分期、分级和肿瘤增殖能力的生物学行为有密切的关系，在 BTCC 的早期诊断和良恶性鉴别诊断中具有重要的参考价值。(本文彩图见封三)KKME-专业医学搜索引擎 http:/ Claffey KP, Wilkison WO，Spiegelman BM.Vascular endothelial growth factor. Regula-tion by cell differentiation and activated sec-ond messenger pathways. J Biol Chemi,1992, 267 (23): 16317-16322.2 Zhang L, Hann
13、ay JA, Liu J, et al. Vas-cular endothelial growth factor overexpression by soft tissue sarcoma cells: implications for tumor growth, metastasis, and chemoresis-tance. Cancer Res, 2006, 66 (17):8770-8774.3 Karpanen T, Egeblad M, Karkkainen MJ,et al. Vascular endothelial growth factor Cpromotes tumor
14、lymphangiogenesis and intra-lymphatic tumor growth. Cancer Res，2001, 61 (5): 1786-1790.4 陈合群,张雪培,申鹏飞. MMP-2 和 MMP-9 在膀胱癌组织中表达的免疫组化研究.中国现代医学杂志,2003,13(12):78-80.5 王嵩,张智清.膀胱癌组织中血管内皮生长因子的表达及与血管生成的关系.中华外科杂志,2000,38(1):34-36.6 Aguayo A,Kantarjian HM,Este4y EH,et al.Plasma vascular endothelial growth fact
15、or levels have prognostic significance in patients with acute myeloid leukemia but not in patients with myelodysplastic syndromes.Cancer,2002,95(9):1923-1930.7 Thaloor D,Singh AK，Sidhu GS,et al.Inhibition of angiogenic differentiation of human umbilical vein endothelial cells by KKME-专业医学搜索引擎 http:/ Growth Differ,1998,9(4):305-312.8 Campbell SC,Volpert OV,Ivanovich M,et al.Molecular mediators of angiogenesis in bladder cancer.Cancer Ras,1998,58(6):1298-1304.9 李文平.血管内皮生长因子在膀胱肿瘤中的检测意义.河北医药,2002,24(11):867-868.可以免费下载论文的浏览器可以免费下载论文的浏览器-文献检索浏览器文献检索浏览器
