《P38MAPKiNOS信号通路对肾脏缺血预处理延迟保护效应的实验研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《P38MAPKiNOS信号通路对肾脏缺血预处理延迟保护效应的实验研究（24页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、山西医科大学硕士学位论文PMAPK/iNOS信号通路对肾脏缺血预处理延迟保护效应的实 验研究姓名：张慧峰申请学位级别：硕士专业：肾脏病学指导教师：李荣山20060410山西医科大学硕士学位论文摘要目的探讨P a M A P K 与i N O S 在肾脏缺血预处理时两者的上下游关系，旨在阐明肾脏缺血预处理延迟保护的可能机制。方法雄性w i s t a r 大鼠6 0 只，随机分为五组，每组1 2 只大鼠，分别为：假手术( s h a m ) 组，缺血再灌注( I R ) 组，缺血预处理+ 缺血再灌注( Z P C + I R ) 组，S B 2 0 3 5 8 0 组，氨基胍( A G ) 组，
2、各个组按再灌注2 4 h ，4 8 h 两时间点又分为两小组，每小组6 只大鼠。用苦昧酸法与二乙酰一肟法检测肾功能变化情况；用H E 法观察肾组织形态；用T U N E L法观察肾小管上皮细胞凋亡情况以及W e s t e r nb l o t 法检测肾组织P a M A P K 与i N O S 蛋白的表达，图像分析仪进行半定量分析。结果血肌酐，细胞凋亡指数在I P C + I R 组较I R 组低( p O 0 5 ) ；在4 8 小时I P C + I R 组值达最低，与其它各组相比( p 0 0 5 ) ，表明i N O S 抑制剂A G 不影响P 3 。M A P K 的表达，( 见
3、f i g I I ) 。7表3 缺血预处理时不同时间点P 。s M A P K 蛋白表达的变化注为S h a m 组与其它组相比P O 0 5 ) ；在4 8 小时I R 组发现随着再灌注时间的延长，棕黄色颗粒( 即T U N E L 阳性细胞) 出现明显增加，与后三组相比，( P 2 m i n ，再灌注 2 5 m i n ，持续缺血 6 0 m i n ，而且其保护作用可分为：早期保护( e a r l yp r o t e c t i o nE P ) ，在短暂缺血后立即开始，持续卜2 h ，3 h 基本消失；延迟保护( d e l a yp r o t e c t i o nD P
4、 ) 又称为第二窗口保护，在最初缺血后1 2 h 开始起效，1 2 h 一2 4 h 作用达高峰，7 2 h 基本消失。二者的诱发条件有一定差异，延迟I P C 可能需要强的刺激，一般至少是4 次的缺血再灌注( I R ) 循环，且二者产生的保护作用也有一定差异。肾脏缺血预处理的保护作用，由于实验对象，实验模型及I P C 方案的不同，得出不同的结论。但已有大量研究指出，肾I P C 对肾脏起保护作用。而且近期的一些实验结果提示，I P C 对肾脏的保护作用类似于心脏I P C ，也可能同样存在E P 和D P 两个时相的保护作用。1 1 肾脏I P C 的早期保护J e f a y r i
5、在右肾切除左肾动脉夹闭的大鼠模型上，采用缺血4 m i n ，再灌注l l m i n ，循环4 次，后行缺血4 5 m i n 再灌注的方案，成功的诱发了肾脏E P 的效应。在再灌注后第2 h ，6 h 测血肌酐浓度，发现预处理组与单纯缺血组相比，无明显差异，但I P C 可使缺血再灌注后第6 h 左肾组织细胞空泡变性和核固缩明显减轻，一氧化氮合酶( N O S ) 表达上调。认为I P 的保护作用可能是通过一氧化氮( N O ) 的释放尤其是内皮型一氧化氮合酶( e N O S )表达上调产生的。O g a w a 。”等用不同的I P 方案，即采用缺血4 m i n ，再灌注3 0 m
6、i n 后行缺血3 0 m i n ，再灌注6 0 m i n ；及缺血5 m i n 再灌注5 m i n 后行缺血3 0 m i n 再灌注9 0 m i n 后，发现：与单纯I R 组相比，肾小球滤过率( G R F ) ，肾血流量，N a 排泄分数在I P + I R 组均有明显改善。分别应用缺血2 m i n ，3 m i n ，4 m i n ，再灌注5 m i n 的肾I P C 方案，在预处理后3 0 m i n ，用s u b t r a c t i v e 杂交技术，可检测到3 9 种基因的m R N A 表达上调，这些基因编码的蛋白质1 6尤其是细胞骨架肌动蛋白可参与蛋白
7、质折叠与细胞结构的重建，还可使A T P 酶活性快速恢复从而改变可利用的细胞能量来源“1 。1 2 肾脏I P c 的延迟保护目前，多数学者集中于I P C 对肾脏D P 效应和发生机制的研究。T o o s y ”1 应用大鼠模型，分别以肾脏组织超微结构和9 9 1 n T c D M S A 核素扫描作为肾功能评价指标，行缺血4 m i n ，再灌注lI m i n ，重复4 次，5 m i n 后行缺血4 0 m i n ，在第0 ，2 ，9 天用放射性显像9 9 m T c 来检测残留肾功能，结果显示，平均最大肾功能损害出现在单纯I R 组术后第2 天，而I P C + I R组损伤较
8、单纯I R 组轻，第9 天时两组肾功能均有恢复。得出结论是：在肾缺血前5 m i n 行I P C 能显著保护随后的缺血再灌注损伤。L e e 在行右肾切除夹闭左肾动脉的大鼠模型上，采用缺血8 m i n ，再灌注5 m i n ，循环4 次，再缺血4 5 m i n 后灌注2 4 h 的方案，通过观察不同指标进行的一系列实验中，证实I P C 对肾功能及组织有保护作用。“。在随后的实验中，该作者将人类近端肾小管上皮( H K 一2 ) 细胞置于浓度为5 0 0 u m o lH 。0 ：的环境中进行1 5 m i n 氧化损伤预处理发现，该预处理可使H K 一2 细胞耐受随后浓度为2 5 m
9、 m o l 的H 。O ：环境”3 。也有学者采用缺血2 m i n ，再灌注5 m i n ，循环3 次，缺血4 5 m i n ，再灌注2 4 h 也成功的诱发出了肾脏D P 效应，而且证实该效应可能与e N O S 合成增多有关。3 。在缺血4 5 m i n 之前行上述同样的I P 方案，在2 w 后通过检测相关指标也得出同样的结论o 。S u g i n o 等学者采用缺血3 m i n ，灌注5 m i n ，重复3 次，缺血5 0 m i n ，再灌注1 2 0 m i n 的方案，也成功的诱发了肾脏的D P 效应“。肾脏D P 效应观察最长的是在再灌注1 2 W 后，发现I
10、P C 可使白细胞浸润减少，减少l 肾损伤分子k i m - i ( k i d n e yi n j u r ym o l e c u l e 一1 ) 的表达以及减轻细胞骨架肌动蛋白对肾组织的损伤作用，从而改善缺血后的肾功能”“。但也有一些实验得出了相反的结论。对猪肾脏的I P C 研究发现，预处理组行缺血，复灌各l O m i n ，循环3 次，然后行缺血6 0 m i n ，复灌8 m i n ，结果发现，与I R 组( 缺血6 0 m i n ，复灌8 m i n ) 相比，I P C + I R 组并无减轻肾功能障碍及组织学损伤的作用 1 3 JoI s l a m “4 1 对大
11、鼠肾也行I P C ，并利用放射性核素对肾功能进行观察，也得出相同的结论。总之，多模型，多种方案的研究结果，证实肾脏I P C 对后续的肾脏I R 起保护作用，有些研究结果一致，可能与动物种类，实验模型及不同的I P C 方案有关。但从目前的研究结果分析，I P C 可通过激活体内的多种物质，而发挥l 肾脏保护作用。2 肾脏IP c 对肾缺血再灌注损伤保护的机制尽管I P C 涉及多种因素的参与，机制复杂，但心脏的I P C 机制已逐渐明朗化，已有大量研究认为，该机制大致如下：各种预处理刺激心肌释放多种内源活性物质，这些物质通过胞内信号转导途径激活各种核内转录因子产生大量心肌保护蛋白，细胞因子
12、等：或开放细胞膜上的离子通道，发挥保护作用，具体包括3 个环节：( 1 ) 内源触发物质的释放，并作用于细胞膜；这些物质包括：N O ，N O S ，腺苷及其受体，阿片类物质及受体等：( 2 ) 启动胞内信号转导途径：如t 蛋白激酶C ( P K C ) ，酪氨酸蛋白激酶( T K ) ，丝裂原活化蛋白激酶( M A P K ) ；( 3 ) 终末效应物质发挥作用：这些物质有核因子k B ( N F k B ) ，诱导型一氧化氮合酶( i N O S ) ，环氧合酶一2 ( C O X 一2 ) ，A T P 敏感的钾通道( K 。) 等。每个环节众多物质的参与并相互影响，共同起到了心肌的延迟
13、保护作用；而心肌的早期保护作用机制主要与K ，的开放，e N O S 释放增多有关。在肾脏的I P C 研究中，有多数文献报道I P C 机制与心脏I P C 有相同之处，但又不完全一致。2 1 腺苷及其受体关于腺苷在肾脏I P C 中的作用，L e e 等学者先后进行了广泛深入的研究，证实：腺苷在缺血预处理后的E P 效应与D P 效应中，均发挥作用，且腺苷A ，腺苷A ，R 激动剂，腺苷A 。R抑制剂均可模拟出反复4 次，缺血8 m i n ，再灌注5 m i n 诱发的E P ，给予腺苷A 。R 抑制剂或A 。R 激动剂则作用相反”3 ，认为I P C 细胞内信号转导和腺苷的药物预适应机
14、制是通过G 蛋白和蛋白激酶C 介导的，同时该作者还排除了K 。缓激肽，m u s c a r i n i c 和阿片受体在肾I P C中的作用”1 。进一步在人类肾近端小管上皮H K 一2 细胞培养时，将该细胞在缺乏A T P 的环境中进行预处理后，发现腺苷A ，R 激动剂或腺苷A 2 a R 激动剂能够明显减轻H K 一2 细胞对随后更严重的A T P 缺乏造成的损伤，而且腺苷A 。R 或腺苷A ：。R 介导的保护作用是通过不同的细胞内信号转导途径，腺苷A R 依赖于G ( i o ) 蛋白而A ：。R 则依赖于蛋白激酶A 的激活“。但也有研究指出 h i 尽管内源性腺苷可能减轻随后的I R
15、 损伤，但腺苷A 。R 拮抗剂与A ，R 拮抗剂均不能消除I P C 中腺苷的保护作用，认为腺苷受体的活化并未促进I P C 的保护效应，从而推出腺苷在I P C 中的保护作用可能是非受体介导的，但具体机制仍有待于进一步研究。2 2P 。M A P K丝裂原活化蛋白激酶( m i t o g e na c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e sM A P K s ) 是一类高度保守的丝苏氨酸蛋白激酶，与细胞增殖，分化或调亡密切相关的细胞内信号转导酶类，共有三条通路P 洲A P K ，J N K ，E R K ；P 3 8 M A P K 由缺血缺氧，应激
16、等多种胞外刺激激活。缺血预处 理可激活P 舭P K “6 “1 。有作者报道“，缺血缺氧可显著减低与缺血相关的P 。M A P K ，J N K的活性，而对缺血后的E R K 活性没有影响，提出E R K 和P 。M A P K ，J N K 通道之间的动态平衡决定肾细胞的最终命运。将H K 一2 细胞置于氧化损伤的环境中观察，用P 3 J c l A P K 磷酸化抗体可检测到在缺氧预处理后P 3 8 M A P K 迅速活化，进一步观察到P s s M A P K 的保护作用与P 3 8 M A P K诱导的血红素加氧酶一1 ( H o _ 1 ) 及热休克蛋白一2 7 ( H S P 一2 7 ) 合成增加有关，用S B 2 0 3 5 8 0( P a , N A P K 的阻断剂) 可消除这种保护作用8 1 。在人类肾脏上皮细胞A 4 9 8 株培养的实验中发现，将该细胞置于I N F Y 以及T N F n 等细胞因子培养液中，i N O S 表达上调，进一步发现M A P K S 可诱导i N O
