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1、黑龙江中医药大学硕士学位论文囊立消胶囊抗癫痫作用机制的实验研究姓名：郭艳莹申请学位级别：硕士专业：中西医结合基础指导教师：吴勃岩20060501黑龙江中医药大学硕士学位论文缩略语表英文缩写英文全称A E D sA n t i e p i l e p t i cd r u g sA s pA s p a r t i ca c i dB C S FB r a i n c e r e b r a ls p i n a lf l u i dB eB e m e g r i d e C N SC e n t r a ln e r v o u ss y s t e mE A A - - RE x c i
2、t a t o r ya m i n oa c i d - - r e c e p t o r E A A sE x c i t a t o r ya m i n oa c i d sE pE p i l e p s y G A B A丫一a m i n o b u t y r i c G A Dg l u t a m i c a c i d d e c a r b o x y l a s eG l uG l u t a m i ca c i dG l yg l y c i n e G Rg l u c o c o r t i c o i d r e c e p t o rI A A sI n
3、 h i b i t o r ya m i n oa c i d sI L - 1pi n t e r l e u k i n 一1DI L 一1r aI n t e r l e u k i n1r e c e p t o r a n t a g o n i s tK AL P 0 M D AN EN E I NN I N N M D AN oS O DT N FK a i n i ca c i dL i p i d sp e r o x i d em a l o n d i a l d e h y d en o r e p i n e p h r i n eN e u m e n d o c
4、 r i n o i m m u n o l o d i c a ln e t w o r kN e u r o i m m u n o l o g yn e t w o r kN - - m e t h y l - - D a s p a r t a t eN i t r i co x i d eS u o e r o x i d ed i s m u t a s eT u m o rn e c r o s i sf a c t o r中文名称抗癫痫药物天冬氨酸脑，脑脊液美解眠又名贝美格中枢神经系统兴奋性氨基酸受体兴奋性氨基酸类癫痫v 一氨基丁酸谷氨酸脱羧酶谷氨酸甘氨酸糖皮质激素受体抑制性氨
5、基酸类白细胞介素一1D白细胞介素1 受体拈抗剂红藻氨酸脂质过氧化物丙二醛去甲肾上腺素神经一内分泌免疫网络神经一免疫网络N 一甲基D 门冬氨酸 一氧化氮超氧化物岐化酶肿瘤坏死因子黑龙江中医药大学硕士学位论文中文摘要囊立消胶囊是在中医药基本理论指导下组方的，它自创制以 来，广泛应用于临床，治疗脑囊虫病。通过数十余例临床观察证实其具有较好杀灭囊虫、对抗脑囊虫所致的癫痫作用。故现以癫痫症为研究切入点，对该方抗癜痫作用及作用机制进行深入研究，并为以后进一步探讨该方的作用机理提供科学的实验依据。目的：研究囊立消胶囊的抗癫痫作用及其作用机制。为今后临床应用提供参考依据。方法：背部皮下注射美解眠复制癫痫大鼠模
6、型，药理实验方 法观察该方对大鼠癫痫行为表现的影响；通过观察该方对癫痫大鼠脑中氨基酸G A B A 、G l u 、A s p 、G l y 含量的变化及细胞因子I L 1B 、T N F 一含量的变化，探讨该方治疗癫痫症的神经一免疫机制。结果：1 背部皮下注射美解眠后大鼠痫性发作；2 该方具有 抗癫痫作用，减少癫痫大鼠的癫痫发作程度，延长痫性发作的潜伏期，与模型对照组比较差异有显著性意义( P 0 0 5 ) ，说明对抑制性氨基酸G l y 含量没有影响；而囊立 消组、苯妥英钠组对癫痫大鼠脑中G l y 含量的影响与模型对照组比较差异无显著性意义( P O 0 5 ) ，说明囊立消胶囊治疗癫
7、痫大鼠的机制可能通过增加其脑中抑制性氨基酸G A B A 含量实现的。表4 对癫痫大鼠脑内G I u 含量的影响( 孑J )注：经t 检验与模型组比较：+ P o 0 5与空白组比较：+ + P 0 0 5表4 结果表明：模型对照组与空白对照组比较差异有显著性意义( P O 0 5 ) ，模型组可增加兴奋性氨基酸G l u 含量；囊立消组黑龙江中医药大学硕士学位论文可明显减少美解眠化大鼠脑内G l u 的含量，与模型组比较差异有显著性意义( P 0 0 5 ) ；而苯妥英钠组也可减少癫痫大鼠脑中G l u含量，与模型对照组比较差异有显著性意义( P O 0 5 ) ，且苯妥英钠组减少G 1 u
8、 的含量优于囊立消组，说明囊立消胶囊治疗癫痫大鼠的机制可能通过降低其脑中兴奋性性氨基酸G l u 含量实现的。表5 对癫痫大鼠脑内A s p 含量的影响( j s )注：经t 检验与模型组比较：+ P 0 0 】“P O 0 5与空白组比较：十 + P 00 1表5 结果表明：模型对照组与空白对照组比较差异有显著性意义( P 0 0 1 ) ，模型组可增加兴奋性氨基酸A s p 含量；囊立消组可明显减少美解眠化大鼠脑内A s p 的含量，与模型组比较差异有显著性意义( P O 0 5 ) ；而苯妥英钠组也可减少癫痫大鼠脑中A s p 含量，与模型对照组比较差异有显著性意义( P 0 0 1 )
9、 ，且苯妥英钠组减少A s p 的含量优于囊立消组，说明囊立消胶囊治疗癫痫大鼠的机制可能通过降低其脑中兴奋性性氨基酸A s p 含量实现的。4 3 对美解眠致痫大鼠脑内细胞因子含量的影响4 3 1 对癫痫大鼠脑内I L 1 B 含量的影响将左侧大鼠脑组织迅速从低温冷冻冰箱中取出，在冰冷的蒸馏水中洗净血液，置于冰冷的平皿上分离所需部位，滤纸拭干，电子天平精确称重。置于预先盛有冰冷生理盐水的玻璃匀浆器中， 生理盐水总量为脑组织重量的3 倍，匀浆2 3 m i n 。将匀浆液以3 ，0 0 0 r p m 低温离心lo m i n ，沉淀变性蛋白，抽取上清液，备用。严格按照试剂盒说明书进行I L 1
10、 鲫芟射免疫法检测，按下表操作黑龙江中医药火学硕士学位论文T N FR I A 加样程序( u 1 )N S BS oS 1 S 6U缓冲液2 0 01 0 0一标准品一1 0 0一样品一l O O12 5 I T N F1 0 01 0 01 0 0l0 0 抗T N F 血清1 0 0l O Ol0 0充分混合，4 温育2 4 h 以上充分混匀，室温放置2 0 m i n ，然后在4 ，3 5 0 0 r p m ，离心2 5 m i n吸弃上清夜，在自动Y 计数器上进行检测。结果见表7 。表7对癫痫大鼠脑内T N F 旺含量的影响( z s )注：经t 检验与模型对照组相比较：+ P 0
11、 0 5与空白对照组相比较：+ P o0 1由表7 的结果可见，美解眠化癫痫大鼠脑中细胞因子T N F 一含量有所增加，与空白对照组比较差异有显著性意义( P O 0 1 ) ；囊立消组可以降低癫痫大鼠脑中的T N F n 含量，与模型对照组比较差异有显著性意义( P 0 0 5 ) ；苯妥英钠组脑中的T N F a 含量 与模型对照组比较差异有显著性意义( P O 0 5 ) 。说明囊立消胶囊治疗癫痫大鼠的机制可能通过降低其脑内T N F 一来含量实现的。综合表6 、7 可以看出囊立消胶囊可能是通过降低细胞因子T N F a 、I L 1 B 的含量来达到治疗癫痫目的。黑龙江中医药大学硕士学
12、位论文讨论一模型的建立癫痫是一种临床综合征，主要为反复发作大脑神经元异常放电所致的大脑功能失调。它是神经系统的多发病之一，治疗较为困难。目前，癫痫治疗以药物治疗为主，但使用单一药物效果常常不满意，往往需要复合药物治疗。即便如此，药物控制的有效率也只有7 0 8 0 左右。因此需要动物模型进行癫痫病基础及抗癫痫药物研究”。通过实验研究，探讨其发病机理，寻找有效的治疗方法，是研究癫痫的重要途径。癫痫的实验性研究始于18 8 3年O 口e n c h o w s k i 首次采用冷冻大脑组织造成脑内致痫灶。目前，癫痫动物模型的建立方法较多，癫痫动物的种类各异，而其中癫痫动物模型的选择又是极为关键的问
13、题。 1 海人酸模型 海人酸( K A ) 是脑内兴奋性氨基酸、谷氨酸的结构类似物，脑内核团微量注射K A ，具有选择性损伤神经元而不损伤过路的神经纤维的神经毒作用而被引进神经科学的研究。K A 可造急性癫痫模型，是具有双羧基的酸性氨基酸，脑内或系统给予惊厥剂量的K A ，可诱发动物出现实验性癫痫发作。K A 癫痫模型已被世界广泛接受作为人类颞叶癫痫的动物模型，这是它不仅具有人类颞叶癫痫( 精神运动性癫痫) 、急性癫痫发作的行为特征，而且具有与人类颞叶癫痫极为相似的神经病理改变( 海马硬化) 。 2 马桑内酯模型马桑内酯是一种低分子量化合物，其致痫作用与戊四氮相似，可对神经细胞产生损害。马桑内
14、酯诱发癫痫模型的优点在于成功率较高，模型较为稳定，且与癫痫的临床表现较为相似。朱长庚等根据吴良芳等方法用健康小白鼠，将马桑内酯作腹腔注射，每隔3 5 d 注射1 次，共注射5 7 次。经反复多次注射马桑内酯后，动物被点燃，出现全身性阵挛强直性痫样发作，表现为四肢痉挛、强直、呼吸急促、身体扭曲等。其症状与大鼠马桑内酯点燃模型黑龙江中医药大学硕士学位论文加，动物对刺激的反应也逐渐加强( 1 4 级) ，直至产生全身阵挛 性发作( 5 级) 。G o d d a r d 于1 9 6 9 年建立了经典的点燃癫痫模型，当 时采用的方法是每日1 次，每次1 秒的高频( 6 0 H z ) 电刺激大鼠杏仁
15、核，刺激间隔时间不短于2 0 m i n 。传统的点燃方法约需l 2 周。点燃动物，必须激发杏仁核放电，造成大脑神经元群的同步放电及扩布。点燃模型的一个最显著特点是：癫痫一旦形成，动物对 癫痫刺激的敏感性将永久存在，这与临床上癫痫症长期反复发作的特征相似。点燃的刺激部位以杏仁核最为常用也最为敏感，其次是腹侧海马内皮层和前梨状皮层深部，但红核、黑质、脑干网 状结构和中央灰质等处不易形成。尽管刺激的部位不同，但点燃形成后动物脑内的神经病理变化却是完全相同的。电刺激法能有 效的避免外源性化学物质的干扰，为人类癫痫发作的病理生理研究、A E D s 的筛选等提供了可靠的手段。7 听源性发作模型听源性发
16、作是由强音引起的一种发作，表现为阵挛强直阵挛性发作，这种发作与遗传有关。D B A 2 ( D 2 ) 种小鼠是A G S s 小鼠的典型代表，在强音刺激下，其发作之全过程为：刺激开始有一定的潜伏期，而后奔跑1 次或2 次，中间有一短暂的休止期，继而 进入全身阵挛性发作，倒向一侧，四肢强烈抽搐。部分小鼠发生强直性发作，四肢强直性向后伸展，呼吸暂停，如果此期不能很快恢复，常致死亡，其死亡率为6 0 7 0 。故使其应用受到限制。 8 癫痫样小鼠癫痫样小鼠是1 9 5 4 年在日本发现的一种癫痫动物实验模型，目前国际已公认它是一种遗传性癫痫模型。这种小鼠在前庭受到刺激时引起发作，如将其放在一块小板上，反复向空中投置数次，即引起强直阵挛性惊厥，同时伴有大量流涎，以上述方式引起反复发作10 余次以后，多数小鼠在换窝或置于新环境时，可导致自然发作。该小鼠在3 0 d 左右开始发作，性成熟期
