《ClC3氯通道对过氧化氢诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞凋亡的影响》由会员分享，可在线阅读，更多相关《ClC3氯通道对过氧化氢诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞凋亡的影响（115页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、中山大学博士学位论文ClC-3氯通道对过氧化氢诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞凋亡的影 响姓名：周园申请学位级别：博士专业：药理学指导教师：关永源20050501C I C 3 氯通道对过轼化氢诱导的大鼠主动脉i F 滑J I L 自I I 胞凋f 的彤l 响中文摘要C 1 C 一3 氯通道对过氧化氢诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞凋亡的影响专业：药理学博士研究生：周园导师：关永源教授氯离子通道是普遍存在于胞浆膜及胞内细胞器膜上的跨膜蛋白，通过有选择性地使氯离子进出细胞调节细胞的多种功能，如细胞膜电位的稳定、胞内p H的维持、跨上皮细胞物质转运、激素分泌、兴奋性的调节等。C I C 一3 氯通道隶属于C
2、I C 氯通道家族，其通道特性和功能目前尚未完全清楚。D u a n 等的研究结果提示C I C 3 可能编码了容积调节性氯通道，但随后的一些研究对该假设持否定观点，我们实验室最近的研究结果表明，在A 1 0 血管平滑肌细胞上C I C 一3 氯通道参与了细胞容积调节，是容积调节性氯通道的分子基础。细胞容积的稳定是维持细胞正常生理功能的重要环节，而在不同的生理或病理情况下，细胞的容积常发生改变，表现为皱缩或肿胀，此时细胞通过启动调节性容积增加( r e g u l a t o r yv o l u m ei n c r e a s e ，R V I ) 或凋节性容积减低( r e g u l
3、a t o r yv o l u m ed e c r e a s e ，R V D ) 机制可使细胞容积恢复正常。近年研究发现除了参与调节细胞容积外，容积调节性氯通道在免疫反应，细胞膜电位稳定，胞内酸碱平衡以及细胞的增殖、分化、凋亡等过程中亦发挥了重要作用。细胞生氏、增殖及凋亡过程都伴随有细胞容积的改变。细胞分裂增殖的早期，大多数细胞都会因为代谢增强而增加氨基酸、有机、无机等营养物质的摄取，同时伴随水的进入，导致细胞肿胀，容积增大。细胞容积的改变，激活细胞膜K + 通道i F I C I 通道，通过R V D 过程使细胞体积恢复到正常。而细胞凋亡过程中胞体皱缩是其典型的形态学变化特征，这种细
4、胞皱缩在等渗条件下即可发生，主要与K + 、c l 外流，及其伴随的H 2 0 的外流有关，被称为凋亡性容积减低( a p o p t o s i sv o l u n l ed e c r e a s e ，A v D ) 过程。研究表明，进行性的A V D 过程最终可以诱发纠胞凋亡，阻断A V D 过程则可以抑制凋亡的发生，提示A V D 可能是细胞凋亡发生的上游事件。fC I C 一3 氯通道对过氧化氯露导的大鼠主动脉甲制! l J t 目l 】胞4 日亡的影响中文 | 8 f 监细胞增殖和细胞凋亡是细胞生理过程的两个方面，增殖和凋亡的平衡维持了细胞内环境的稳态。我们实验室以往的研究表明
5、反义C I C 3 寡核苷酸可抑制E T - 1诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞增殖，提示C I C 一3 氯通道参与了血管平滑肌细胞增硝过程。但对于C 1 C 3 氯通道与血管平滑肌细胞凋亡的关系尚未见报道。基于我们实验室原有的工作基础，C I C 3 氯通道有可能参与血管平滑肌的凋亡，为此本研究围绕该问题，进行如下工作：建立H 2 0 2 诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞凋亡模，诅；观察转染反义C I C 3 寡核苷酸与g p C I C 3 c D N A 对H 2 0 2 诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞捌亡的影响：H 2 0 2 诱导大鼠主动脉平滑肌细胞凋亡过程中静息f C a “ i 的变化及C I
6、 C 一3 氯通道的影响。第一部分：H 2 0 2 诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞凋亡模型的建立氧化应激造成的大量活性氧的产生及其继发性细胞损伤在细胞捌亡过程中起重要作用，近年来的研究表明，活性氧与m 管平滑肌细胞的凋亡密切相关。其中，H ，O ，的半衰期最长，被认为是主要的氧化信号介导者。故而本部分实验选择H ，O ，诱导大鼠主动脉平滑肌细胞，建立稳定的捌亡模型。以M T T 法检测H 2 0 2 对细胞存活率的影响，H o e c h s t3 3 2 5 8 核染色法、D N A琼脂糖凝胶电泳、流式细胞仪观察利分析H 2 0 2 处理后的细胞核形态、D N A 断裂及含量变化的情况，从而选择
7、合适的H 2 0 2 浓度与处理时间，建立H 2 0 2 诱导大鼠主动脉，l t 滑肌细胞凋亡的模型。结果表明：原代培养的大鼠主动脉平滑肌细胞相差显微镜下观察，呈梭形，高低起伏排列呈“峰，谷”状。平滑肌特异的d a c t i n 抗体免疫组织化学法染色，可见胞质中细丝状棕黄色阳性反应物，纯度 9 5 ，可用于后续实验。5 0 1 6 0 0 9 m o lL 1 1 2 0 2 过氧化氢处理细胞2 4 h ，细胞存活率随H 2 0 2 剂量增加而逐渐降低，分别为8 8 0 1 2 3 、8 50 士1 0 O 、8 49 士1 l3 、6 76 士56 、5 5 4 78 、90 70 5
8、( p O0 5 ，n = 6 ，v sc o n t r 0 1 ) 。f f i g p C I C 一3c D N A 转染组的细胞用H 2 0 2 处理6 h 、1 2 h 、1 8 h 、2 4 h 后，胞浆静息c a ”值分别为8 3 7 m 1 3 7 、6 7 1 6 7 、6 0 9 e 5 6 、3 6 7 4 1 ，均低于p c D N A 3 1 - R A S M C s 组( n = 6 ，P I N 0 3 - B r C l a s p a r t a t e 。 g l u c o n a t e 。D I D S ，N P P B ，9 - A C 及抗雌激
9、素药物t a m o x i f e n 等可明显阻断孩通道电流【1 2 - 13 1 。3 C I C 3 氯通道与容积调节性氯通道I ：h 于缺乏特异性通道阻断剂和未发现不含容积调节性氯通道的细胞株，容积调节性氯通道的分子基础迄令尚未完全明了。已经提出的候选对象有C I C 2 1 4 - 1 5J ，p - 糖蛋白( P g p ) ，蛋白p l C l no 7 1 羊C I C 3 等，最近的研究表明P - g p0 1 8 1 “和蛋白p M n 2 0 1 本身不构成离予通道，可能只是容积调节性氯通道的涮节分子；砷C I C 2 氯通道电流的生物物理学和药理特性与容秘调节性氯通道
10、又存在较大差异I “I 。1 9 9 7 年，D u a 【1 【2 1 I 的研究结果表明，C I C 一3 氯通道与细胞容积调节有密切关系，可能是容秘调节性氯通道的分子基础。C I C 3 氯通道是C I C 氯通道家族的成员之一，”泛表达于哺乳动物的组织和细胞，包括胰脏、心、肝、肺、脾、眼、回肠、气管、脑内皮细胞、血管平滑肌细胞、非色素视上皮细胞、免疫细胞等，尤其高表达于脑、肾及肠道。其基因最初在大鼠的肾脏中得到克隆和鉴定，O l l r C I C 3 ，之后，h C I C 一3 、m C I C 3 、g p C l C 一3的c D N A 相继由人胚胎脑细胞、小鼠肝细胞和豚鼠心
11、肌细胞得到克隆和测序中山人学博士学位论文C I C 一3 氯通道对过氧化氯秀导的大鼠主动脉，f t 坩叭细胞凋亡的影响 2 2 - 2 9 。由于与C I C 4 和C I C 5 有近8 0 的氨基酸序列相同，在C I C 基因家族中，C I C 3 、C I C 一4 和C I C 5 构成一个亚家族”I 。C I C 一3 蛋白由1 3 个疏水性结构域( D l D I3 ) 组成，其中D I D 1 2 为跨膜区，蛋白的氨基端和羧基端均位于胞浆侧。D 3 D 5 区可能形成通道的离子孔道，D 3 羧基端至D 5 区间的氨基酸序列是决定C I C通道不同亚型离子选择性的决定簇1 3 1
12、“】。突变分析结果表明，5 7 9 位中性天冬氨酸与C I C 一3 通道的离子选择性和整流特性密切相关，氨基端5 l 位和D 5 区3 6 位丝氨酸残基可能是两个重要的磷酸化位点，5 】位氨基酸可能参与构成通道的容积敏感器口”6 1 。D u a n 等 2 1 , 3 5 - 3 6 1 对C I C 3 氯通道的特性及调节机制的一系列研究结果显示，将g p C I C - 3 稳定转染于N I H 3 T 3 细胞，C I C 一3 氯通道可被低渗溶液( 2 5 0m O s mk g 。)诱导的细胞肿胀所激活，被高渗( 3 5 0m O s mk g 。1 ) 引起的细胞皱缩所抑制。其
13、通道电流具外向整流特性，在正电位时缓慢失活，单通道电导值约为4 0 p S ，其离子选择性顺序为I 一 C I 。 A s p a r t a t e - g l u c o n a t e ，C I 一通道阻断镕U D I D S 、抗雌激素药物t a m o x i f e n H P K C 激动齐I J P D B u 等可明显抑制该电流。C 1 C 3 氯通道的上述特性与多利，组织细胞内源性容积调= 净性氯通道电流相似，提示C I C 3 可能编码了容积调节性氯通道。之后的一些实验结果也支持泼假设口7 4 4 ：( 1 ) C I C 3 在体内广泛分布，与V R A C 功能相吻合
14、。( 2 ) C I C 一3 第5 7 9 位甘氮酸突变可以改变I c lc I c ，3 的整流特性及离子选择性，表日f J g p C l C 3 为一功能性氯通道。( 3 ) C I C 3 反义寡核苷酸抑制牛的无色素睫状体上皮细胞、H e l a 细胞、非洲爪蟾卵母细胞内源性C I C 一3 后，可以浓度依赖性地抑制I c I 。l 及R V D 过程。( 4 ) 胞内透析或注射抗C 1 C 3 的抗体后，可以明显降低或取消犬肺动脉平滑肌细胞、豚鼠心肌细胞及爪蟾卵母细胞内源性I c Iv o l 。但随后一些研究结果对此持否定观点，如W e y l a n d t 等“5 “1 的实
15、验结果显示C I C 3 呈特异性分布，C 1 C 3 遍布整个细胞，但主要分布于细胞核；W e i n m a n t 4 7 - 5 0 l等将r C I C 3 异源表达于C H O K 1 细胞，记录到的I c lm 3 呈强的外向整流特性，但对细胞容积变化不敏感，电流特性与I c lv o l 有较大差异，将r C I C 3 同时异源表达于C H O K 1 及H u h 7 细胞，观察到胞内大的囊泡结构的形成，囊泡的形成与C I C 3 过度表达有关，提示C I C 一3 可能是一个胞内的氯通道，参与囊泡的酸化作用。中山火学博 j 学位论文C I C 一3 氯通道对过氧化氢诱导的
16、人鼠土动脉平卅n 儿绷胞捌亡的影响我们实验室最近的研究表明：g p C I C 一3c D N A 转染A 1 0 血管平滑肌后，低渗激活的氯电流幅度明显增强，T dc l c 3 电流特性与A 1 0 细胞内源性l c l 、。I 相似；C I C 一3 反义寡核苷酸转染或胞内透析抗C I C 一3 抗体可明显抑制或完全取消A I O 细胞内源性容积凋节氯电流，提示C I C 3 氯通道是A 1 0 血管平滑肌细胞容积调节性氯短道的分予基础1 。二、细胞凋亡细胞凋亡是多种生理、病理因素参与的由凋亡相关基因启动的细胞主动死亡过程，是维持机体内环境稳定所必需的。在多细胞生物体中，细胞数量的生物稳态是通过细胞分裂、增殖与凋【：之间的相互平衡实现的，这种平衡对于生物体的发育和正常结构与功能的保持有重要意义。过度的细胞捌亡或凋亡不足，均能导致疾病。1 细胞凋亡与心血管系统疾病
