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1、2 0 0 3 年全国危重病急救医学学术会议论文集失血性休克诱发M O D S 的病理机制及其山莨菪碱的保护作用第四军医大学西京医院急诊科( 西安7 1 0 0 3 2 ) 尹文虎晓氓张松涛刘健黄杨宋祖军本文模拟临床，采用失血性休克诱发多器官功能障碍综合征( M O D S ) 家兔模型。观察山莨菪碱( 6 5 4 2 )治疗前后肺泡巨噬细胞( P A M ) 和肝枯否氏细胞( K C ) 中I K B 激酶( I K K - B ) 、核因子( N F ) 一x B 和上清液肿瘤坏死因子( T N F ) 一d 以及内脏组织的病理生理变化，从分子水平探讨M O D S 的发病机制和6 5 4
2、 2 可能的治疗作用。1 材料与方法1 1 动物模型与分组：健康大耳白兔2 4 只，6 个月龄，雌雄不限，体重( 2 0 7 0 2 3 ) 吨。用3 戊巴比妥钠( 1 m l k g ) 耳缘静脉注射麻醉。随机分为3 组：M O D S 模型组( M 组，8 只) ，分离右侧股动脉插管接三通，监铡正 常血压后在1 5 m i n 内快速抽出血液( 肝素化后室温保存) ，使平均动脉压降至4 0 m m H g 左右，通过回输或抽血的方法维持该水平6 0 m i n ，随后回输全部血液( 回输时间大于3 0 r a i n ) ；6 5 4 2 治疗组( T 组，8 只) ，制备模型步骤同上，在
3、回输血液时另外腹腔注射6 5 4 - 2 ( 3 m g k g , 1 0 m l 生理盐水稀释) 。监测血压平稳后，上述两组动物各腹腔注射L P S ( 1 0 p g k g ，2 0 m l 生理盐水稀释) ，放回笼中观察，自由饮水进食。正常对照组( c 组，8 只) ，无特殊处理。1 2观察指标及方法：I 2 1M O D S 的诊断标准：肺衰竭：低氧血症，P 0 2 8 0 U L ；肾衰竭：少尿，B U N 1 7 6 ，8 0 m m O L L ：胃肠道衰竭：黏膜出血，糜烂，溃疡形成。出现2 个或2 个以上器官衰竭者即可诊断为M O D S 。1 2 2 各组动物分别在注射内
4、毒紊后2 4 H 活杀取材。留取动脉血做血气分析及生化检查；留取肝脏左叶和肺左下叶和小肠组织，石蜡包埋、切片，经H E 染色常规病理学光镜检查。1 2 3P A M 的分离：处死动物后对各组动物进行支气管肺泡灌洗，分离培养P A M ，留取细胞及上清液待测。1 2 4K C 的分离：各组动物取中肝叶，经残留血管注入肝素( 1 2 5 U M L ) 3 M L ，立即灌注3 9 的H e p e s溶液至肝脏变白，继之以3 9 0 C 的0 2 5 胶原酶溶液反复灌注直至肝脏松软后，继续在3 7 ：U 消化1 5 分钟，去除肝包膜及纤维结缔组织，2 0 0 目钢丝网过滤，制成细胞悬液，差速离t
5、 j , 5 0 0r r a i n 离心2 M I N , H e p e s 溶液悬浮细胞，共3 次，取3 次的上清1 5 0 0r m i n 离心3 M I N ，弃上清；再次重复上述步骤。】留细胞沉淀，加含2 0 小牛血清的1 6 4 0 培养基培养6 小时，收集贴壁细胞，即获得K c ，苔盼蓝染色检测细胞活性，碳粒吞噬实验检测细胞纯度。 1 2 5 原位杂交方法( I S H ) 检测P A M 和K C 中I K K Bm R N A 的表达：分离出的P A M 和K C 爬片6 小时，多聚甲醛固定2 0 r a i n ，一2 0 0 C 保存备用。t K K - B 原位杂
6、交试荆盒及焦碳酸二乙酯( D E P C ) 购自武汉博士德公司，实验步骤参照说明书进行。1 2 6I K K B 阳性杂交信号的相对含量测定：用Q 一5 0 0 图象分析仪( 美国L e i c a 公司) 进行原位定量分析，各组动物每只家兔随机检测2 0 个阳性细胞，每组动物各测1 6 0 个细胞，用细胞阳性杂交信号的吸光度( A 值) 表示I K K B 的相对含量。1 2 7E M S A 法检测P A M 和K C 核蛋白提取物中N F K B 的活性：提取P A M 和K C 核蛋白；测定核蛋白浓度。进行E M S A 实验，利用凝胶分析系统进行密度扫描，以扫描值表示N F K B
7、 活性水平。并通过特异性 竞争实验( 加1 0 0 倍未标记N F K B 探针代替标记探针) 对N F - K B 进行特异性检测。1 2 8E L I S A 法检测P A M 和K c 培养上清液中r N F - 含景：E L I S A 试剂盒为我校免疫教研室产品。1 3 统计学处理；实验数据用牙s 表示，采用单因素方差分析。 2 结果：2 1 各组动物造模后2 4 小时血气分析及生化检查结果见表1 。7 72 0 0 3 年全国危重病急救医学学术会议论文集注：与对照组比较+ P 0 0 I与模型组比较p 0 0 l ；P O0 52 2 病理结果：模型组肺脏体积增大实变，表面有大小不
8、等的散在红斑片，切面成红色实变；镜下肺泡壁破坏严重，肺间质及肺泡腔水肿，渗出，出血，大量粒细胞侵润，肺泡腔内透明膜形成；肝脏表面可见出血 点，光镜下肝汇管区可见大量中性粒细胞及枯否氏细胞，部分肝细胞嗜酸性变有坏死灶形成。小肠黏膜水肿、糜烂，镜下见上皮细胞变性、坏死、脱落。黏膜腺体萎缩，固有膜有中性粒细胞浸润。6 5 4 2 干预组各脏器炎症改变明显减轻；肺组织炎症细胞减少，出血、渗出减轻。肝组织未见坏死灶形成；小肠黏膜变性、坏死明显减轻，少量中性粒细胞浸润。对照组肺肝小肠组织为正常病理形态。 2 3 各组动物P A M 和K C 胞浆中I K K - 1 3m R N A 的表达变化和相对含量
9、测定见表2 ：I K K - I B 阳性反应信号呈棕黄色，背底不着色。阳性反应信号分布在细胞浆中，细胞核内阴性。M 组动物的1 K K - 1 3 的表达远高于c 组( P 0 叭) ，而T 组I K K B 的表达虽高于c 组( P 0 0 1 ) ，但与M 组动物比较有明显降低( P 0 0 5 ) 。 2 4 各组动物P A N 和K C 细胞核中N F - K B 的活性变化和细胞培养上清液中T N F _ a 的变化见表2 。表2P A M 和K CI K K _ B 表达，N F K B 的活性和上清液T N F a 含量变化I n = 9 ，娃s )肺泡巨噬细胞( P A N
10、)肝脏枯否氏细胞( K C )I K K BN F K BT N F c t ( n g L )I K K - 1 3N F K BT N F a ( n g L )M 组0 ，1 5 0 , 0 3 + l + 4 9 0 ，3 0 *2 7 9 7 4 2 5 9 1 + 0 A 7 0 0 4 “1 7 2 ：t - 0 3 6 +3 0 0 0 5 3 0 8 6 T 组0 1 0 - 0 0 2 + A O 6 5 0 1 0 “ + 1 8 0 6 1 1 3 0 1 * AO 1 1 0 0 2 * A A0 8 8 0 2 0 + + 2 1 0 2 8 1 8 0 1 AC
11、组O 0 3 0 O l0 2 5 0 0 61 3 7 3 3 ：e 6 0 9O0 2 0 0 10 3 1 0 1 01 3 4 8 5 1 20 9：注：与对照组比较+ ) O 0 1 # P O 0 5 ；与模型组比较一) 0 0 5P 0 0 53 讨论：研究发现，失血性休克常常并发肠道性菌血症，因此，失血性休克时失血和感染双重因素对机体造成了双重打击，易发生M O D S ，肝肺胃肠等脏器为损伤的主要靶器官。本实验模拟l 临床失血性休克过程制备动物模型，诱发M O D S ，经血气分析、A L T 、B U N 等生化指标和肺肝小肠等病理检查证实，实验动物不同程度出现两个或两个以
12、上脏器衰竭，说明本实验M O B S 模型是成功的。6 5 4 - 2 治疗组光镜下内炷组织炎症病理改变有不同程度减轻，提示6 5 4 2 在休克、内毒素诱发的M O D S 组织损伤中起到了一定的保护作用。N O D S 的发生机制是错综复杂的，其中炎症细胞的普遍激活和介质释放是基本机制，以T N F - a 为主的细胞因子最终引发和导致了器官损害。N F K B 是重要的转录因子，活化后发生核移位，与靶基因结合，广泛调控T N F - - e t 等细胞因子，黏附分子和炎症相关的酶及蛋白质的表达，直接参与失撒性休克后脏器的损伤。I K K 是I K B 激酶。有I K K d ，I K K
13、 f 3 j K K 一7 三种亚型，其中I I ( K - 8 是N F - K B 活化所必需的，它诱导I K B 磷酸化，使N F K B I K B 二聚体解离，暴露了N F K B 的核定位序列，是N F - K B 的活化和移位的前提。T N F d 等细胞因子主要由单核细胞产生，肝脏枯否氏细胞占所有单核细胞的8 0 ，在全身及肝脏局部的炎症反应中起关键作用。肺脏有着丰富的毛细血管床，往往成为炎症损伤的最先靶器官。急性肺损伤( A u ) 本身又可启 动全身其他器官损伤，而肺外器官的损伤也可诱发A u ，A u 和M O D S 存在着共同的发病机制。由此，实验筛选了肺泡巨噬细胞和
14、肝枯否氏细胞作为参与全身炎症病理反应的靶细胞进行实验，充分反映了机体受到损伤后免疫细胞的激活状态。本实验原位杂交及相对含量测定结果显示：模型组动物肺泡巨噬细胞，肝枯否氏细胞中I K K Bm R N A的表达明显增高，而正常对照组细胞中I K K Bm R N A 几乎无表达。说明机体在受到休克和内毒素后可刺7 82 0 0 3 年全国危重病急救医学学术会议论文集激靶细胞，激活I K K - 3 。E M S A 和E L I S A 结果显示：模型组家兔较正常动物比较肺泡巨噬细胞和肝枯否氏细胞中N F K B 的活性和上清液T N F - c 含量随I K K Bm R N A 表达的改变同
15、步升高。而6 5 4 2 治疗组明显下调I K K p 的表达，降低N F - K B 的活性和T N n “的分泌。实验结果一方面说明：机体在受到休克、内毒素等刺激后可激活I K K B ，使I K B 磷酸化降解、N F K B 移入核内，上调T N F q 等细胞因子基因转录。另一方面说明6 5 4 2 通过抑制激酶I K K - 1 3 的表达、阻止N F - K B 活化和T N 卜的合成、分泌。 实验结果显示，I K K - 1 3 在失血性休克介导M O D S 的病理生理反应和内脏组织器官损害中发挥重要作用。6 5 4 - 2 通过影响I K K 一1 3 N F - K B
16、T N F d 传导通路发挥对M O D S 的保护作用。横断性胰腺损伤1 6 例深圳市布吉人民医院外一科( 5 1 8 1 1 2 ) 范德标摘要：本文总结1 6 例横断性胰腺损伤的救治体会，笔者认为，患者有上中腹部暴力撞击史，有腹膜炎表现，行剖腹探查时，尤应注意探察胰腺，及时发现胰腺的损伤。对于胰腺的横断性损伤，胰尾部断裂作运断切除术；胰体部断裂作近断端缝闭，远断端与空肠套人式吻合术；如能找到近、远断端胰管内支架胰腺吻合术；对有合并十二指肠破裂者，情况允许作胃及胆囊切除，将十二指肠憩室化，利于十二指肠及胰腺裂口的愈合；对于胰瘘形成后，半年仍不愈合的，行I I 期内引流术。对于胰头部的损伤尽量不作胰十二指肠切除，这样
