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1、 网址： 第 1 页，共 3 页斑点印迹杂交法检测四环素抗性基因斑点印迹杂交法检测四环素抗性基因中华皮肤科杂志 1999 年第 3 期第 32 卷 短篇论著作者：骆 丹 聂刘旺 鲁晓萱 黄澍杰 谢礼豪 徐文严 朱文元单位：骆丹 朱文元 210029 南京医科大学第一附属医院皮肤科；聂刘旺 鲁晓萱 南京铁道医学院生物 教研室；徐文严 中国医学科学院 中国协和医科大学皮肤病研究所；黄澍杰 谢礼豪广东省江门市皮肤 病防治所解脲支原体(Uu)是一种缺乏细胞壁、因而对 内酰胺类抗生素治疗无效的微生物，故对 Uu 感染引起的 临床症状常用四环素、红霉素类等药物治疗。因上述药物的广泛使用，四环素抗性基因(t
2、etM)在各种微生 物间的转座或转化作用等，使 Uu 耐药株不断增加。通过微生物药物敏感性试验(MIC)及聚合酶链反应(PCR) 技术可检测耐药程度、耐药种类及四环素耐药决定子(tetM)。本研究拟对 tetM 标准株 PCR 扩增产物进行地 高辛标记制备成核酸探针，再行斑点印迹杂交试验。现报道如下。一、材料与方法(一)药品、试剂与实验菌株：标准品盐酸四环素由中国生物制品检定所提供；PCR 相关试剂均购自华美及 复华生物工程公司；HybondN 尼龙膜为英国 Amersham 公司产品；地高辛(Dig)标记检测系统试剂盒为德 国宝灵曼公司产品。42Uu 株为临床非淋菌性尿道炎(宫颈炎)患者泌尿
3、生殖道分泌物培养鉴定后阳性株标本， 传代 3 次后收集备用于 MIC 测定、PCR 扩增模板及基因组 DNA 提取后的分子杂交。(二)TRNGtetMPCR 产物的回收、纯化与标记：将 200LTRNGtetMPCR 产物经 1.5琼脂糖凝胶电泳后， 取出 DNA 荧光带置 Eppendorf 管中捣碎，加等体积平衡酚振荡摇匀及70冰冻各 10min，12000r/min 离 心 10min 后再按酚氯仿抽提法制备纯化 DNA，20保存以备标记用。标记前首先变性模板 DNA，按试剂 盒说明在冰上依次加入相应试剂，37保温过夜后，终止标记反应，再行乙醇沉淀漂洗所标记的 DNA 探针， 并以 TE
4、 溶解保存。(三)Dot?Blot 印迹杂交：分别将 UutetMPCR 产物 3L 及 Uu 分离株 DNA 提取物模板 10L 加热变性冷却后 直接点膜于 HybondN 尼龙膜上，80烘烤 2h 固定膜上 DNA。以预杂交液(50去离子甲酰胺，5Denhart 液，0.1g/mL 变性鲑鱼精子 DNA 等)68预杂交 2h。变性 DNA 探针后加入正式杂交体系， 68杂交过夜。次日经高浓度到低浓度 SSC 洗涤后，封闭非特异性杂交，依照试剂盒说明进行免疫检测显 示杂交结果。二、结果(一)Uu 株四环素 MIC 分布与 tetM 基因扩增检测：42 株 Uu 对四环素敏感性的检测表明，MI
5、C 达 8g/mL网址： 第 2 页，共 3 页以上有 12 株；30 例 tetM 决定子阳性的 Uu 株其 MIC 水平分布于 0.0632g/mL。(二)tetMPCR 产物的斑点印迹杂交：以载 tetM 的 TRNG 作为对照，经 PCR 扩增、琼脂糖凝胶电泳回收纯化 及标记后，对上述 30 例 PCR 阳性产物进行斑点印迹杂交分析。结果出现阳性杂交信号 28 例，阴性 2 例。(三)不同 MIC 株 DNA 提取物的斑点印迹杂交：采用前述核酸探针与各浓度的 Uu 株 DNA 提取物直接点膜杂 交，结果只有 MIC16g/mL 以上的 Uu 株 DNA 才可出现阳性杂交信号，此探针不能
6、与 MIC8g/mL 以 下的 Uu 分离株 DNA 提取物反应出现肉眼可见的杂交信号，12 例 PCR 扩增检测阴性者亦未出现阳性杂交信 号。三、讨论采用 96 孔板微量肉汤稀释法筛选药物敏感株是经典的微生物敏感性试验，此法可同时检测某种微生物对 多种抗菌药物在不同浓度下的敏感性如何，但存在检测时间长，判断易有主观性等问题。分子生物学技术 如核酸探针、PCR 扩增等均可通过检测微生物自身的药物抗性基因存在与否来检测耐药菌株。我们的实验 结果发现 tetM 抗性基因的 PCR 阳性检测率并非完全与 MIC 浓度有明确相关性，即 tetM 抗性基因阳性与否 与 MIC 浓度大小无明显相关，但 t
7、etM 阳性提示有可能从敏感株发展成中度敏感株(MIC=8g/mL)或耐药株(MIC16g/mL)，因此在性病临床防治及流行病学研究方面应予重视及监测随访。为进一步阐明耐药基因与 MIC 检测的关系，本研究采用核酸探针技术分别对药物抗性基因的 PCR 产物及基 因组 DNA 进行斑点印迹杂交分析。结果表明地高辛标记的 TRNG?tetMPCR 产物核酸探针可与 Uu 株 28/30 份 PCR 产物产生阳性杂交信号，其阳性率为 93.3，将此探针直接与分离株 DNA 提取物点膜杂交后发现， 只有 MIC16g/mL 和 MIC=32g/mL 者可出现阳性杂交信号，低于此浓度者未获阳性杂交结果。
8、此说明 耐药基因经过 PCR 扩增后，tetM 决定子的拷贝数可能增多，可通过核酸探针这一敏感性相对较低的方法检 测之；MIC 达 16g/mL 以上的培养物 DNA 提取物模板能被标记的 tetM 核酸探针检测出来是否与拷贝多少 相关尚不清楚。值得提出的是若以 MIC16g/mL 判为 Uu 耐四环素药物的水平标准，则核酸探针检测的 结果与之吻合，此亦便于为临床治疗提供参考。而 PCR 检测法颇为灵敏，在 MIC=0.06g/mL 时即可出现 阳性结果。因此可将 PCR 扩增作为筛查耐药基因携带株的检测手段，并以核酸探针杂交分析对 PCR 结果进 一步肯定证实，同时亦可对 MIC 测定的耐药
9、程度或耐药性加以佐证。参考文献1 朱慧兰，徐广坤，赖维，等.解脲支原体中 tetM 基因的检测及临床应用评价.中华皮肤科杂志, 1998,31:185186.2 骆丹，黄澍杰，谢礼豪，等.解脲支原体对七种抗菌药物的敏感性测定及其与相关耐药基因检测的比较.中 华皮肤科杂志,1998,31:152155.3 卢圣栋主编.现代分子生物学实验技术.北京：高等教育出版社.1993.4 Kenny GE, Cartwright FD, Susceptibilities of Mycoplasma hominis, Mycoplasma pneumoniae, and Ureaplasma urealyticum to new glycyclines in comparison with those older tetracyclines. Antimicrob Agents Chemother, 1994,38:2628 2632.网址： 第 3 页，共 3 页(收稿：19980804 修回：19990104)
