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1、胚胎造血干胚胎造血干 ScalScal 细胞向肝细胞分化的细胞向肝细胞分化的 研究研究【摘要】目的探讨胚胎造血干细胞抗原阳性(Scal) 细胞亚群在合适的体外诱导体系下向肝细胞或肝细胞前体分化的可行性。方法免疫磁性分离法分离 Scal细胞,相差显微镜观察细胞形态,RTPCR 法检测细胞白蛋白(ALB) 、转甲状腺蛋白mRNA 水平表达,免疫组织化学法检测 AFP 和 CK8/18 蛋白水平的表达,以及检测细胞糖原染色和尿素合成功能。结果免疫磁性分离法分离 Scal细胞能达到(85.571.66)%的纯度(0.05),显示应用免疫磁性分离法纯化 Sca1+细胞可以明显提高细胞的纯度而基本不影响细
2、胞活力,回收率平均为(62.311.85)%。2.2 细胞形态学观察接种 24h 后细胞贴壁,贴壁的细胞呈较大的圆形,数量稀少,散在存在,48h 后贴壁细胞开始分裂增殖,72h 后贴壁细胞形成几个细胞的克隆,形态均一,贴壁后的细胞增殖迅速。诱导后 14d,部分细胞开始出现类似肝细胞样变化,细胞体积大,呈圆形或者不规则多边形,边界清晰,排列紧密,部分呈条索状排列。诱导后 21d,细胞的肝细胞样变化较前明显分散,克隆样增殖的小上皮样细胞集落,胞浆丰富,核大,边界清楚。诱导 28d 时,细胞的肝细胞样变化更加明显,细胞体积变大,呈条索状排列的细胞增多(图 14) 。图 1 接种 12h 后,可见细胞
3、贴壁伸展(略)图 2 诱导 7d,多数细胞已经贴壁,伸展,少数细胞间互相接触(略)图 3 诱导 14d 细胞呈规则的多边形双核及三核细胞,多见细胞间接触密实,且相互连接呈片状(略)图 4 诱导 21d 细胞呈多边形,细胞间相互接触更明显(略)2.3 免疫细胞化学检测 AFP、CK8/18接种至培养基中的细胞诱导 0 d 时 AFP 有少量表达,而 CK8/18未见有表达。诱导 7d 后 AFP 高表达,14d 表达率降低,21 及28d 时 AFP 未见表达。CK8/18 在 7d 时有少数细胞呈阳性表达,以后随着诱导的时间延长至 14、21、28d 时,表达率逐渐升高,表明实验组中细胞逐渐向
4、成熟的肝细胞分化(图 56) 。2.4 RTPCR 检测白蛋白,转甲状腺蛋白的 mRNA 表达接种至培养基中的细胞诱导 0d 时,白蛋白有少量表达,而转甲状腺蛋白的 mRNA 未见有表达。白蛋白 mRNA 在 7d 时有少数细胞呈阳性表达,转甲状腺蛋白的 mRNA 无表达。转甲状腺蛋白的mRNA 在 14d 开始有表达,以后随着诱导的时间的延长至14、21、28d 时,白蛋白、转甲状腺蛋白的 mRNA 表达率逐渐升高;说明了实验组中细胞向成熟肝细胞逐渐转化(图 7) 。2.5 肝功能检测2.5.1 糖原染色 培养 14d 后,可见细胞胞浆内存在有红色颗粒,糖原染色呈阳性反应,以后随着诱导的时间
5、的延长至21、28d,阳性率逐渐升高。显示细胞具有合成糖原的功能。说明细胞向成熟肝细胞分化(图 8) 。图 5 甲胎蛋白免疫组织化学染色阳性(略)图 6 CK8/18 免疫组织化学染色阳性(略)1. 白蛋白;3. 转甲状腺蛋白;2 和 4 为对照组图 7 白蛋白和转甲状腺蛋白的 RTPCR 检查(略)图 8 糖原 PAS 染色阳性(略)2.5.2 尿素合成功能检测 培养 14d 后,培养液内可检测到尿素氮的存在,以后随着诱导的时间的延长至 21、28d 尿素氮浓度逐日升高,说明细胞具有尿素合成和分泌的功能。说明实验组中细胞向成熟肝细胞分化。3 讨论已有研究表明骨髓与肝脏间存在联系,血细胞的生成
6、和肝脏的发育经历着相同的阶段,在胚胎发育期肝脏始终保持着造血功能,伴随着血细胞的生成,造血干细胞也存在于胎儿体内,因此在胚胎发育一定时期内含大量的造血干细胞7 。研究发现胚胎时肝脏 CD34 细胞数高于骨髓,且增殖分化的能力高于骨髓,它的黏附性强,端粒长度与端粒酶活性均与骨髓造血干细胞不同,且具有更强的自我复制增殖和分化潜能,免疫源性和免疫能力远低于骨髓造血干细胞,是极具活性的干细胞之一8 。Lagasse 等9进一步研究发现,骨髓造血干细胞中主要由 ckit+、Lin-、Scal和 Sca1-亚群细胞分化肝实质细胞。由于 Sca1+是小鼠造血干细胞的常用筛选标志,而且分离步骤少,有助于减少细
7、胞损伤和防止多步骤筛选丢失某些干/祖细胞,本实验小鼠胚胎肝干细胞只用 Sca1+标志作免疫筛选,而没有作 CD34+/CD34-、kit+、Thy+及 Lin-/Lin+等筛选。使用免疫磁性分离法,可使 Sca1+细胞分离后的百分比达到85.57%,而且使分离前后细胞的活力不受影响,所以应用免疫磁性分离法纯化 Sca1+细胞可以明显提高细胞的纯度而基本不影响细胞活力。AFP、白蛋白、CK18、转甲状腺蛋白为肝系细胞特异性的标志物;糖原染色和尿素合成功能为肝细胞功能的标志物;本实验使用含一定剂量的 HGF 与 aFGF 的胎牛血清的培养基进行诱导分化,检测 AFP、白蛋白、CK18、转甲状腺蛋白
8、,以及糖原染色和尿素合成功能。AFP 在新鲜接种培养的 Scal细胞中有少量表达,加入一系列的生长因子诱导 7、14d 时表达较高,而诱导21、28d 时无表达;白蛋白在新接种的 Scal细胞中有少量表达,加入一系列的生长因子诱导培养 7、14d 有少数细胞表达,21、28d 时均表达较高,说明随着诱导培养时间的延长,分泌白蛋白的细胞逐渐增多;CK18 在幼稚的肝前体细胞不表达,当肝细胞趋于成熟或已成熟时表达;实验结果支持 Scal细胞向肝细胞分化。而且糖原染色和尿素合成功能加入一系列生长因子诱导后的 21、28d 表达较高,而诱导的 0、7d 无表达;支持了 Scal细胞逐渐分化为成熟肝细胞
9、的过程。本研究从肝系细胞的表型和功能两个方面进行检测,结果都提示了肝细胞标志的逐渐出现和成熟,从而证实了胎肝中含有Sca1+细胞;带有 Sca1+的细胞,具有横向分化的潜力,在体外可向肝细胞或肝细胞前体转化。【参考文献】1 WAGERS A J,SHERWOOD R I,CHRISTENSEN J L,et a1.Little evidence for developmental plasticity of adult hematopoietic stem cells Little evidence for developmentalplasticity of adult hematopoie
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