《Oct34在体外诱导大鼠骨髓间质干细胞神经分化中的作用》由会员分享，可在线阅读，更多相关《Oct34在体外诱导大鼠骨髓间质干细胞神经分化中的作用（76页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、At h e s i ss u b m i t t e dt oZ h e n g z h o uU n i v e r s i t yf o rt h ed e g r e eo fM a s t e rC o n s t r u c t i o no fl e n t i v i r a lv e c t o rO c t 3 4a n dt h er o l eo fi ti nd i f f e r e n t i a t i o no fr a tb o n em a r r o wm e s e n c h y m a ls t e mc e l l si n t on e u r
2、 o n sB yS h u Y a n gW a n gS u p e r v i s o r ：P r o f Y a n ji eJ i aD r W a n g ji n gt a oN e u r o l o g yT h ef i r s ta f f i l i a t e dh o s p i t a lo fZ h e n g z h o uU n i v e r s i t yA p r i l2 0 1 2原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科
3、研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：气氏亿日期：伽年s 月哳日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。保密论文在解密后应遵守此
4、规定。学位论文作者：日期：妒年月彳E l摘要0 c t 3 4 在体外诱导大鼠骨髓间质干细胞神经分化中的作用研究生王舒阳导师贾延劫教授王景涛博士郑州大学第一附属神经内科中国郑州4 5 0 0 5 2摘要背景与目的骨髓间质干细胞( m a r r o wm e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ，M S C s ) 是一类来源于成熟骨髓、脐带血及脂肪组织等多种组织分离出来，具有多向分化潜能干细胞。M S C s 具有很强的自我增殖、多向分化能力，在特定的条件下可以向不同的细胞进行分化，既可以向中胚层组织分化如骨细胞、心肌细胞等，又可以向外胚层组织分化如神经细胞等
5、。M S C S 具有来源方便、增殖能力强大、多向分化潜能等优点，因此在临床主要应用于血液系统疾病，心血管疾病，以及神经系统疾病的诊断与治疗。尤其是在神经系统疾病方面，M S C s 的发现为神经系统变性病、中枢神经损伤等患者提供了新的治疗方法，具有长远的发展前景。诱导M S C s 向神经细胞分化是一种横向的分化方式，存在着分化效率低、分化调节机制不明确等缺点，因此需要进一步研究。0 c t 3 4 是P O U 域家族转录因子中的一员，主要表达于胚胎干细胞及生殖细胞中，是胚胎干细胞多潜能性的维持因子和生殖系细胞的调控因子，是目前已知的与胚胎发育全能性相关的重要转录因子，是哺乳动物体内全能性
6、胚胎干细胞的标志物之一。近年来有研究证明指出0 c t 3 4 对细胞分化的控制是剂量依赖性的，其m R N A 转录水平，或者说蛋白表达水平的不同可能是维持细胞不同的分化状态的主要因素，并且在诱导胚胎干细胞向神经细胞分化过程中，0 c t 3 4 表达水摘要平总是对应相应的神经发生能力，当0 0 3 4 被连续传代减低，神经发生能力就受损。那么O c t 3 4 是否在M S C s 向神经细胞分化过程中起作用尚不清楚。因此，本研究采用慢病毒载体技术。构建0 0 3 4 慢病毒载体，将其感染至大鼠M S C s 中，深入探讨O c t 3 4 在体外诱导M S C s 分化为神经细胞中的作用
7、。材料和方法选取W i s t a r 大鼠为实验对象，雌雄不限，6 “ - 8 周龄，分离、传代培养M S C s ，选取1 0 代以上细胞进行实验。构建大鼠0 0 3 4 慢病毒载体( 0 0 3 4 L V ) 并感染大鼠M S C s ；实验分为感染组( 感染O c t 3 4 L V ) 、阴性对照组( 感染F U P G C N C L V ) 、未感染组3 组；采用B 一巯基乙醇诱导各组大鼠M S C s 分化为神经细胞。倒置荧光显微镜下观察M S C s 感染后形态学变化：M T r 法检测细胞存活率；免疫细胞化学法检测神经元烯醇化酶( N S E ) 、神经微管结合蛋白( M
8、 A P 2 ) 、胶质纤维酸性蛋白( G F A P ) 和0 0 3 4 的表达变化；W e s t e r nb l o t t i n g法检测M A P 2 、0 0 3 4 蛋白的表达变化；R T - P C R 法检测M A P 2m R N A 、0 0 3 4m R N A 的表达变化。结果1 阳性克隆P C R 证明大鼠O c t 3 4 慢病毒载体构建成功，孔稀释法测定病 毒滴度为2 x 1 0 8 眦。2 倒置显微镜下观察大鼠O c t 3 4 慢病毒载体感染成功，M O I 值为1 0 ，感染4 8 h 时感染率最高，荧光表达最强；感染率可达8 3 4 2 2 。感染
9、组中，M S C s形态发生变化；M r r 提示感染组细胞存活率显著降低( P - 2 ，5 二苯基四氮唑溴盐信使核糖核酸达尔伯克氏改良伊格尔培养液磷酸缓冲液胶质纤维酸性蛋白神经微管结合蛋白神经元烯醇化酶B 巯基乙醇感染复数引言0 c t 3 4 在体外诱导大鼠骨髓间质干细胞神经分化中的作用1引言研究生王舒阳一导师贾延劫王景涛郑州大学第一附属神经内科中国郑州4 5 0 0 5 20 c t 3 4 属于P O U 域家族，是重要的转录因子之一，主要存在和表达于胚胎干细胞及生殖细胞中，是胚胎干细胞多潜能性的维持因子和生殖系细胞的重要调控因子，是目前已知的与胚胎发育全能性相关的重要转录因子，是哺
10、乳动物体内全能性胚胎干细胞的标志物【l J 。骨髓间质干细胞( m a r r o wm e s e n c h y m a ls t e mc e l l s ，M S C s ) 是一种具有多向分化潜能的干细胞，在特定条件下可以向脂肪细胞、骨细胞、心肌细胞和神经细胞等分化【到，但具体分化机制尚不清楚。N i w a 等人指出O c t 3 4 对细胞分化的控制是剂量依赖性的，其m R N A 转录水平，或者说蛋白表达水平的不同可能是维持细胞不同的分化状态的主要因素，并且在诱导胚胎干细胞向神经细胞分化过程中，0 c t 3 4 表达水平总是对应相应的神经发生能力，当0 c t 3 4 被连续
11、传代减低。神经发生能力就受损1 3 1 。那么0 0 3 4 是否在M S C s 向神经细胞分化过程中起作用尚不清楚。本实验根据确定的0 c t 3 4 序列，构建0 c t 3 4 基因慢病毒载体，将其感染大鼠M S C s ，然后观察0 c t 3 4 在大鼠M S C s在诱导分化为神经细胞过程中的表达变化，探讨0 c t 3 4 在大鼠M S C s 横向分化为神经细胞中作用。材料与方法2 材料与方法2 1 材料2 1 1 实验动物S P F 级W i s t a r 大鼠，雌雄不限，鼠龄6 8 周，购于河南省实验动物中心，许可证号：s c x K ( 豫) 2 0 0 5 - 0
12、0 0 1 。大肠杆菌株D H 5 a 和2 9 3 T 细胞，由郑州大学生物化学室惠赠。2 1 2实验试剂试剂名称生产厂家A g eIp G C - F U 载体p G C - L V 载体p H e l p e r1 0 载体p H e l p e r2 0 载体胎牛血清D M E M 培养基O p t i - M E M 液体培养基多聚赖氨酸L i p o f e c t a m i n e2 0 0 0I n - F u s i o n T MP C RC l o n i n gK i tR N e a s yM i n i 试剂盒0 0 3 4 兔抗大鼠多克隆抗体美国N E B 公司
13、中国上海吉凯公司中国上海吉凯公司中国上海吉凯公司中国上海吉凯公司美国I n v i t r o g e n 公司美国I n v i t r o g e n 公司美国I n v i t r o g e n 公司美国S i g m a 公司美国I n v i t r o g e n 公司美国C l o n t e c h 公司德国Q i a g e n 公司美国S a n t aC r u z 公司2材料与方法神经微管结合蛋白兔抗大美国鼠多克隆抗体神经元烯醇化酶兔抗大鼠美国多克隆抗体胶质纤维酸性蛋白兔抗大中国鼠多克隆抗体C y 3 标记山羊抗兔I g G 抗体美国Q I A G E N 园O n
14、e S t e pR T - P C R 德国试剂盒凝聚胺美国噻唑蓝美国2 1 3 仪器设备仪器名称超净工作台自动高压灭菌仪倒置荧光显微镜高速台式离心机电子天平酶标仪J M 一2 5 0 电泳仪O p t i M E M 液体培养基P C R 仪一次性滤器一次性培养板S a n t aC r u z 公司S a n t aC r u z 公司上海碧云天公司S a n t aC r u z 公司Q i a g e n 公司S i g m a 公司S i g m a 公司生产厂家美国A i r T e c h 公司日本S a n y o 公司日本O l y m p u s 公司中国上海A n k
15、e 公司德国A d v e n t u r e 公司美国B i o R A D 公司中国大连捷迈科贸有限公司美国I n v i t r o g e n 公司美国P E 公司美国C o m i n g 公司美国C o m i n g 公司3材料与方法一次性培养瓶一次性离心管美国C o m i n g 公司美国C o m i n g 公司2 1 4 培养液及各种主要试剂的配制2 1 4 1 骨髓间充质干细胞完全培养基配制D M E M 培养液胎牛血清谷氨酰胺链霉素青霉素4 “ C 冰箱保存备用。9 0 1 0 0 5 m m o l m l1 0 0 肛g m ll O O u m l2 1 4
16、2P B S 液N a C l8 0 0gK H 2 P 0 40 2 0gK C l0 2 0 9N a 2 H P 0 4 H 2 01 5 6g用1 0 0 m l 三蒸水溶解上述物质，再将三蒸水稀释至1 0 0 0 m l ，经过一次性滤器过滤，4 冰箱存放备用。2 1 4 3D - H a n k s ( p H = 7 2 ) 液N a C l8 0 0 9N a H C 0 30 3 5gK a0 4 0gN a 2 H P 0 4 H 2 00 0 6gK H 2 P 0 40 0 6g酚红O 0 2g用1 0 0 m l 三蒸水溶解上述物质，经过一次性滤器过滤，4 “ C 冰箱保存备用。4材料与方法2 1 4 4 胰蛋白酶+ E D T A 消化液胰蛋白酶O 2 5gE D T A0 0 2gP B S1 0 0m l用l O m lP B S 溶解E D T
