《DNA拓扑异构酶Ⅱα对肿瘤干细胞在胶质母细胞瘤增殖机制中作用的研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《DNA拓扑异构酶Ⅱα对肿瘤干细胞在胶质母细胞瘤增殖机制中作用的研究（56页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、中国医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：i 线日期：竺! 么：篁：砂中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业
2、离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，以采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：丝垫 指导教师签名：三屿E t期01 1 1 ：王望目录舢i | f | f f I I | f I | f l | f f f I ! | I l f I ”I f | I | 舢 Y 2 0 9 2 0 3 2一、摘要中文论著摘要1英文论著摘要5二、英文缩略语9三、论文论文一D N A 拓扑异构
3、酶I I 仅在人脑胶质瘤干细胞中的表达及其对脑胶质瘤干细胞增殖和凋亡的影响1 j 一刖舌1 0材料与方法1 l实验结果1 8讨论2 4结论2 6论文二D N A 拓扑异构酶I Ia 抑制剂对人脑胶质瘤干细胞和非肿瘤干细胞增殖和凋亡的影响1 一j L 一刖吞2 7材料与方法2 8实验结果2 9讨论3 5结论3 7四、本研究创新性的自我评价3 8五、参考文献3 9六、附录综j 苤4 3在学期间科研成绩5 2致谢5 3个人简介5 4中文论著摘要D N A 拓扑异构酶一I IQ 对肿瘤干细胞在胶质母细胞瘤增殖机制中作用的研究目的多形性胶质母细胞瘤( g l i o b l a s t o m am u
4、 l t i f o r m e ，G B M ) 是最常见的恶性程度最高的颅内原发性肿瘤，虽采用各种手段综合治疗，但疗效仍不理想。肿瘤干细胞( c a n c e rs t e mc e l l s ，C S C s ) 是指存在于肿瘤当中具有干细胞特性的一组细胞集群，在肿瘤发生增殖过程中起关键作用。本研究拟在已成功分离鉴定G B M 的C S C s及对增殖相关因子D N A 拓扑异构酶一I Ia ( T o p o i s o m e r a s e - I Ia ，T o p o I II X ) 与G B M增殖关系研究的前期工作基础上，分离G B M 的C S C s 与非肿瘤干细
5、胞( n o n c a n c e rs t e mc e l l s ，n o n C S C s ) 两种细胞，进行体外培养；应用W e s t e mb l o t 及R e a l t i m eP C R等分子生物学手段研究T o p o 1 10 【的表达差异；应用R N A 干扰技术沉默T o p o I Ia的表达，研究T o p o I Ia 对C S C s 增殖、凋亡等生物学特性的影响；进一步应用T o p o 1 10 【抑制剂进行干预，研究细胞增殖及细胞凋亡信号传导通路的变化，明确T o p o I Ia 及其抑制剂对C S C s 在肿瘤增殖过程中作用的影响及机制
6、。本项研究不仅能在分子水平上阐明G B M 的发病机理，还将为G B M 的治疗提供重要的理论和实验依据。方法选购人脑胶质母细胞瘤U 8 7 M G 细胞系模型进行体外培养，应用含生长因子的干细胞培养基培养约1 2 周，分离和鉴定其中的C S C s 及n o n C S C s ；应用W e s t e r nb l o t 及R e a l t i m eP C R 法检测C S C s 及n o n - C S C s 中T o p o 1 10 c 的表达差异；设计并合成了T o p o I IQ 基因特异性的s i R N A 并转染U 8 7 M G 细胞的C S C s ，检测T
7、 o p o I Ia表达沉默对C S C s 的增殖能力、凋亡情况和细胞周期等生物学性状的影响，进一步了解T o p o 1 10 【在脑胶质瘤发生机制中的作用。应用不同类型的T o p o - I Ia 抑制剂H U 3 31 及阿霉素( d o x o r u b i c i n ，D o x ) 干预U 8 7 M G 细胞的C S C s 及n o n C S C s 生长，应用M T T 法及流式细胞仪观察细胞增殖情况和细胞凋亡情况；进一步应用W e s t e r nb l o t 法检测T 0 p 0 1 10 【抑制剂对C S C s增殖及细胞凋亡信号传导通路相关因子( p
8、3 8 M A P K 及c a s p a s e 3 ) 表达的影响，明确T o p o 1 10 【及其抑制剂对C S C s 在肿瘤增殖过程中的作用及影响机制。结果1 、人脑胶质母细胞瘤U 8 7 M G 细胞系的培养及C S C s 的分离与鉴定体外培养U 8 7 M G 细胞系，并应用含有生长因子( E G F ，b F G F ) 的无血清干细胞培养基培养l 一2 周，成功分离出细胞球细胞( n e u r o s p h e r ec e l l s ，N C s ) ，进一步通过C D l 3 3 染色证实N C s 阳性染色率明显高于非细胞球细胞( n o n s p h
9、e r ef o r m i n gc e l l s ，N S F C s ) ；将N C s 打散进行单细胞培养并诱导分化证实其具有多向分化能力；从而证实了N C s 具有能分化成G B M 并使之呈现细胞多样性的特点，具备C S C s的特性。2 、T o p o I I a 在C S C s 和n o n C S C s 中的表达应用R e a l t i m eP C R 和W e s t e r nb l o t 法验证T o p o I Iq 在C S C s 中的表达较n o n C S C s 中显著升高( 尸垒0 31 7 4 - 0 0 4 6 、1 4 7 6 - J
10、= 0 0 8 4 和0 8 9 5 4 - 0 0 6 1 。与A 组相比，B 组和C 组中p - p 3 8 蛋白的表达均有显著上调，差异具有统计学意义( 氏O 0 5 ) ；与D 组相比，E 组和F 组中p - p 3 8 蛋白的表达均有显著上调，差异具有统计学意义( 尸QIT o p o l l a 抑制剂H U 3 3 1 和D o x 对C S C s 引起的促凋亡作用。 _toj 矗逸瀚。j ，k麓麓t f 一2 5邑2 0 Uo 1 5 o董5 盘l Oo o 拿5O H uH u + SD o xD o x + S图6 ，A n n e x i nV 和P I 双标法检测S
11、B 2 0 3 5 8 0 对C S C s 凋亡率的影响( n _ 3 )宰尸 0 0 5V SH ug r o u p 撑P 0 0 5V SD o xg r o u p 讨论在我们前期研究中发现，T o p o 1 10 【在胶质瘤C S C s 中表达显著上调，而且其表达沉默能够显著抑制C S C s 增殖，促进其凋亡。由此我们推测T o p o I Ia 能够通过某种信号传导途径参与调节C S C s 增殖等生物学特性，T o p o I Ia 能够为胶质瘤治疗的新靶点，干预其表达的功能能够抑制C S C s 的恶性表型。为了验证T o p o - I IQ 抑制剂是否能够通过抑制T
12、 o p o 1 10 【的活性，进而影响C S C s 增殖等生物学特性，我们选择了H U 3 31 和D o x ，分别代表两种抑制方式验证二者对C S C s 增殖和凋亡的影响。实验结果证实，H U 3 3 1 和D o x 均能够显著抑制肿瘤细胞的增殖，并促进细胞凋亡；H U 3 31 抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的作用要强于D o x ；而且H U 3 3 1 和D o x 抑制C S C s 增殖和促进细胞凋亡的作用要强于对n o n C S C s 的作用。这就很明确的证实，T o p o I I a 抑制剂确实能够通过抑制T o p o I Ia 的活性，影响C S C s 增殖
13、等生物学特性，遏制C S C s 的恶性表型，从而发挥对胶质瘤的治疗作用。国内外关于H U 3 31 的研究还未见报道，L i n gZ H 等【4 1 】研究发现T o p o 1 10 【抑制剂D o x 和足叶乙甙可使H 4 6 0 细胞发生G 2 M 周期阻滞，抑制细胞增殖，其他研究结果类似【4 引。为了深入研究T o p o I I 伐抑制剂调控C S C s 凋亡等生物学特性的分子机制，我们进一步检测了凋亡相关信号转导通路，如p 3 8 M A P K 和c a s p a s e 一3 信号通路。M A P K 信号转导通路在将细胞外刺激信号转导致细胞及其核内，并引起细胞生物学反
14、应( 如细胞增殖、分化、转化及凋亡等) 的过程中具有至关重要的作用，p 3 8 M A P K 是其重要的组成，p 3 8 激活后形成具有生物学活性的磷酸化p 3 8 ( p p 3 8 ) 4 3 - 4 6 。而c a s p a s e - 3 作为凋亡的执行者，能够启动凋亡的信号并级联放大，从而引起细胞凋亡【4 。7 1 。W e s t e r n b l o t 检测发现，H U 3 3 1 和D o x 均能够显著上调细胞中p - p 3 8和c a s p a s e 3 蛋白的表达；H U 3 3 1 上调p - p 3 8 和c a s p a s e 3 蛋白表达的作用要强于D o x ；H U 一3 3 1 和D o x 对C S C s 上调P p 3 8 蛋白表达的作用要强于对n o n C S C s 的作用。实验结果证实，T o p o I Ia 抑制剂能够上调p 3 8 M A P K 和c a s p a s e -
