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1、V E G F C 在s u r v i v i n 介导的乳腺癌淋巴结转移中的作用研究V E G F Cp l a y sar o l ei ns u r v i v i na f f e c t e dl y m p h a t i cm e t a s t a s i si nb r e a s tc a n c e r导一级学科：坚鏖匡堂论文课题起止时间：2Q ! Q 生垒旦二2Q ! ! 生! ! 旦论文完成时间：至Q ! ! 生! 至旦中国医科大学( 辽宁)20 12 年5 月中国医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究
2、成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名荔f 丝日期：丛哆中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规忌即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大尊本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并
3、向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，以采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签指导教师签日目录一、摘要中文论著摘要1英文论著摘要i 4二、英文缩略8三、论文论文一质粒和慢病毒载体的构建和转染以及s u r v i v i n 和V E G F C 在乳腺癌细胞系中的表达前言1 0 一日看1材料与方法1 l实验结果1 7讨论2 1结论2 2论文二V E G F C 对s u r v i v i n 介导的Z R - 7 5 - 3 0 细胞侵袭能力的影响前言2 3翮青Z 3材料与方法2 4实验结果2 5讨论
4、2 7讨论2 8论文三S u r v i v i n 和V E G F C 在乳腺癌组织及腋窝淋巴结中的表达和与乳腺癌患者临床病理学特征的关系前言2 9翮青Z 9材料与方法3 0实验结果3 2讨论3 7讨论3 8四、本研究创新性的自我评价3 9五、参考文献4 0六、附录综述4 5在学期间科研成绩6 5致谢6 6个人简介6 7中文论著摘要V E G F C 在s u r v i v i n 介导的乳腺癌淋巴结转移中的作用研究目的乳腺癌是在当前女性患者中发病率最高的恶性肿瘤，淋巴转移是乳腺癌细胞向全身扩散的一个重要途径。s u r v i v i n 是凋亡抑制蛋白家族( I n h i b i
5、t o ro f a p o p t o s i sp r o t e i n s ，l A P s ) 的一个成员，它负责调节两个重要的细胞过程，即抑制细胞凋亡和促进细胞增殖。S u r v i v i n 在胎儿发育时期呈高表达，但在健康的成人正常组织中表达极少。然而，在大多数恶性肿瘤中，其又是高表达的。因此s u r v i v i n 可以作为一个潜在肿瘤标记物同时也可以作为肿瘤治疗的靶标。同时，s u r v i v i n 也是与淋巴转移有关的凋亡调节因子。已有研究表明，s u r v i v i n 的表达与乳腺癌等多种恶性肿瘤的淋巴结转移密切相关。V E G F C ( V a
6、 s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o r - C ) 是血管内皮细胞生长因子家族的成员之一，也是调节淋巴管生成的重要因子。V E G F C 是目前发现的最重要的淋巴管生成相关因子，其通过与淋巴内皮细胞上的同族受体酪氨酸激酶V E G F R - 3 。对不同类型的肿瘤进行的研究表明，上调V E G F C 的表达能促进肿瘤淋巴管的形成并增加肿瘤细胞向淋巴结转移的几率。V E G F C 的表达能在肿瘤的内部或者周围形成大量的淋巴管道，以此来促进肿瘤向淋巴结甚至远处的器官转移。此外，V E G F C 也能在淋巴结中促进形成
7、新的淋巴管。在化学诱导的皮肤癌变模型中，研究发现V E G F C 促使的前哨淋巴结肿淋巴管网络的扩张是先于肿瘤转移发生的。目前，在胃癌，结直肠癌等多种肿瘤中发现V E G F C 的表达与淋巴管道的生成、淋巴结转移甚至患者的预后呈正相关。S u r v i v i n 的另一被证明的作用是能够促进肿瘤内新生血管的生成。实验显示靶向抑制s u r v i v i n 的表达后，可以通过促进肿瘤细胞死亡和阻止新生血管生成来抑制肿瘤的生长。S u r v i v i n 的这个作用被发现与血管内皮细胞生长因子家族中的V E G F 有密切关系。如上所述，s u r v i v i n 和V E G
8、 F C 在肿瘤淋巴转移中所起到的作用已经被认知，然而，两者之间是否存在联系的讨论尚缺乏。本文拟通过研究s u r v i v i n 与V E G F - C在乳腺癌细胞、乳腺癌组织和乳腺癌腋窝淋巴结中表达的相互关系，从而深入探讨s u r v i v i n 和V E G F C 在乳腺癌淋巴转移中的重要作用，为乳腺癌患者的淋巴转移情况预测和病情评估找到合适的指标。并为治疗乳腺癌淋巴转移以及远处转移提供准确的靶向目标。材料和方法1 、本实验的研究对象为人乳腺癌细胞株Z R 7 5 3 0 和人乳腺癌组织、腋窝淋巴结组织。2 、构建携带针对s u r v i v i n 和V E G F C
9、 的s h R N A 质粒载体和携带扩增s u r v i v i n的慢病毒载体。通过脂质体法将质粒转染到Z R 0 7 5 3 0 乳腺癌细胞中。按M O I = 2 0将慢病毒转染到Z R - 7 5 3 0 乳腺癌细胞中。转染成功后，通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达来检测质粒和慢病毒的转染效率。3 、设计空白对照组，阴性质粒对照组，阴性慢病毒对照组，s u r v i v i n s h R N A质粒组，V E G F C s h R N A 质粒组，s u r v i v i n 慢病毒组和s u r v i v i n 慢病毒转染V E G F C S 1 1 I 埘A 质
10、粒组。4 、通过蛋白质电泳观察s u r v i v i n 和V E G F C 在不同组别中的蛋白水平的表达。5 、通过r e a l t i m eP C R 技术观察s u r v i v i n 和V E G F C 在不同组别中的m R N A水平的表达。6 、使用T r a n s w e l l 小室，通过细胞侵袭实验观察经转染s u r v i v i n 慢病毒和V E G F C s h R N A 质粒的乳腺癌细胞的侵袭能力的变化。7 、收集乳腺癌组织和腋窝淋巴结组织样本，通过免疫组织化学分析s u r v i v i n和V E G F C 在1 0 8 例乳腺癌组织
11、和腋窝淋巴组织的表达情况，以及它们与患者的临床病理特征之间的关系，并进行统计学分析。观察s u r v i v i n 和V E G F C 表达的相关性及两者表达与乳腺癌患者阳性淋巴结转移的关系。2缝里皇口7 尺1 、经质粒转染的Z R 7 5 3 0 细胞在荧光显微镜下观察到绿色荧光，质粒感染率为7 0 。2 、经慢病毒转染的Z R - 7 5 3 0 细胞在荧光显微镜下观察到绿色荧光，慢病毒感染率为1 0 0 。3 、蛋白质电泳发现经质粒转染的细胞表达s u r v i v i n 和V E G F C 水平降低，经慢病毒转染的细胞表达s u r v i v i n 水平升高。4 、在蛋
12、白水平和m R N A 水平，V E G F C 在Z R 7 5 3 0 细胞中的表达随s u r v i v i n表达的升高而升高，随s u r v i v i n 表达的降低而降低。其中，m R N A 水平上，在s u r v i v i n - s h R N A 质粒组和s u r v i v i n 慢病毒组中V E G F C 的表达与空白对照组相比出现明显下降( p 1 8 ) 后使用。2 、将R N A 反转录为e D N AR T 反应液组成( 3 份反应液体积) ：1 5O l i g od TP r i m e r ( 5 0 9 M )1 5R a n d o m
13、6m e r s ( 1 0 0 9 M )R N A1 51 5R N a s ef r e eH 2 01 8T o t a l3 0R T 反应条件：温度( )时间反应过程3 71 5 m i n反转录反应8 55 s e e反转录酶失活反应3 、R e a l - t i m eP C RP C R 反应液组成：试剂使用量( 9 1 )S Y B R T M P r e m i xE xT a q T MI I ( 2 )1 2 5P C RF o r w a r dP r i m e r ( 10 0 M )P C RR e v e r s eP r i m e r ( 10 0 M
14、 )R T 反应液( c D N A 溶液)1 O1 O2dH20(灭菌蒸馏水)85T 0 t a l2 5P C R 反应条件： 一一_ - 一 温度( )时间( s e c )循环次数反应过程一_ - 一9 53 01预变性9 55 4 0P C R 反应6 03 0一一_ 一( 五) 统计学分析1 6应用S P S S13 0 软件进行统计学分析。所有数据均以均数士标准差表示，采用单因素方差分析( A V O N A ) 的L S D 方法对各组间数据进行比较。实验结果一、慢病毒和质粒转染Z R - 7 5 3 0 细胞的转染率荧光显微镜观察阴性对照质粒和阴性对照慢病毒转染Z R - 7 5 3 0 细胞的结果。如图1 所示，质粒载体的细胞转染率约为5 0 0 0 - 7 0 。慢病毒载体的细胞
