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1、C D C 25 B 和14 3 3 0 在肾癌中作用的相关研究R e s e a r c ho nt h eR o l eo fC D C 2 5 Ba n d1 4 3 3oi nt h eR e n a lC a n c e r论文课题起止时间2QQ 2 生2 月二2Q ! ! 生2 旦中国医科大学( 辽宁)2012 年4 月中国医科大学研究生学位论文独创性声明删Y 删2 0 9 删1 删2 舢棚5 M 3本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我
2、校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：斗日期：中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容
3、除外) ，以采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：指导教师签名：日期：目录一、摘要中文论著摘要1英文论著摘要5二、英文缩略语1 0三、论文论文一前一言”1 1刚舌”材料与方法1 l实验结果l6讨论一l9结论”2 0论文二前占一2 1 刖舌一材料与方法2 l实验结果2 6讨论”2 9结论3 0论文三前占”3 1 日U 舌”材料与方法3l实验结果3 5讨论”4 l结论”4 2四、本研究创新性的自我评价4 3五、参考文献”4 4六、附录综j 签“4 8在学期间科研成绩6 5致谢”6 6个人简介6 7中文论著摘要C D C 2 5 B 和1 4 3 3 0 在肾癌中作用的相关研究j J ko
4、 ! ! ! 刖舌肾癌中绝大多数为肾透明细胞癌，根治性手术切除是肾癌最有效的治疗方法，晚期肾癌的治疗一般不推荐手术切除，而且肾癌对放疗和化疗均不敏感，因此近年基因治疗成了研究的新方向，如果能找到新的癌基因和抑癌基因，并作为新的治疗靶点应用于临床，将有望对肾癌的诊断及治疗提供帮助。C D C 2 5 B 是C D C 2 5 家族中重要的成员之一，是细胞有丝分裂的激活剂，可以加速细胞分裂。目前认为，C D C 2 5 B 所编码基因是一种新的癌基因，过量的C D C 2 5 B 可促进肿瘤的生长和细胞的恶性转化。由于C D C 2 5 B 在细胞有丝分裂中的重要作用，且与多种肿瘤有着密切关系，所
5、以成为目前研究的热点。现已经证明C D C 2 5 B 在人类多种肿瘤中都有过度表达，其中包括：前列腺癌、食管鳞癌、乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、头颈部癌、胃癌、非小细胞肺癌、甲状腺肿瘤、神经母细胞瘤和子宫内膜癌。在肾癌中尚未有相关检测。1 4 3 3 蛋白家族是真核生物细胞中一类含量丰富的高度保守的蛋白质，目前1 4 3 3 蛋白与癌症相关的主要证据来源于1 4 3 3 0 ，1 4 3 3 0的表达水平在各种各样的转染细胞系以及乳腺癌、胃癌、肝癌中都有显著下降，这种表达水平的下降主要由于1 4 3 3 0 的启动子被甲基化。研究表明，C D C 2 5 B 蛋白丝氨酸磷酸化后，可以成为1 禾3
6、3 0 的一个蛋白结合点，1 4 3 3 0 蛋白通过与C D C 2 5 B 结合，调控C D C 2 5 B 的核浆穿梭运转，因此1 4 3 3 0 可能与C D C 2 5 B 的N L S和N E S 协同，来调控C D C 2 5 B 的动态核浆穿梭转运及其亚细胞定位，从而影响细胞周期进程。研究表明，C D C 2 5 B 是1 4 3 3 0 蛋白的可能的作用底物。目的本项目通过肾透明细胞癌组织和细胞中C D C 2 5 B 和1 4 3 3 0 蛋白作用及相互作用的研究，揭示这两个蛋白在肾透明细胞癌细胞增殖、凋亡和侵袭力过程中发挥的重要作用，进一步来指导临床上肾癌的诊断与治疗。l
7、实验方法l 、检测不同临床病理分期的肾癌组织中C D C 2 5 B 和1 4 3 3 0 蛋白表达和活性。从临床病例中选取术后病理回报为I 、I I 、I I I 级肾癌组织各3 0 例通过免疫组化、W e s t e r nB l o t 和R T - P C R 分别检测C D C 2 5 B 和1 4 3 3 0 蛋白表达。使用癌旁组织作为对照组。2 、分别检测C D C 2 5 B 和1 4 3 3 0 蛋白在肾癌7 6 9 P 和A C H N 细胞中的表达。( 1 ) W e s t e r nB l o t 和R T - P C R 检测C D C 2 5 B 蛋白在肾癌7 6
8、 9 P 和A C H N 细胞中的表达。( 2 ) W e s t e r nB l o t 和R T - P C R 检测1 4 3 3 0 蛋白在肾癌7 6 9 P 和A C H N 细胞中的表达。3 、挑选表达量大的细胞系分别转染C D C 2 5 B s h l A 和l4 3 3 0 s h R N A 。7 6 9 P 和A C H N 细胞置于含1 0 胎牛血清的1 6 4 0 培养基中，3 7 5 的C 0 2 ，孵箱内培养至对数生长期。用0 2 5 胰酶消化并调节细胞浓度以每孔1 0 6 个细胞接种于6 孔板中。实验分为C D C 2 5 B s h R N A 、1 4
9、3 3 0 s h R N A 、c o n t r o ls h R N A 组并设置正常空白对照组，s h R N A 浓度均为2 0 p m o l 。转染7 6 9 - P 和A C H N 细胞方法和步骤参照脂质体说明书进行。转染4 8 h 后进行后续操作。4 、检测转染后的肾癌细胞增殖、凋亡和侵袭力的改变。( 1 ) M T T 法检测细胞增殖能力；( 2 ) A n n e x i nV F I T C P I F C M 实验来检测肾癌细胞的凋亡；( 3 ) T r a n s w e l l 检测肾癌细胞侵袭力。25 、W e s t e r nB l o t 和R T -
10、P C R 检测转染1 4 3 3 0 s h R N A 的肾癌细胞中C D C 2 5 B 的表达，及转染C D C 2 5 B s h R N A 的肾癌细胞中1 4 3 3 0的表达。实验结果l 、C D C 2 5 B 蛋白在各组中的表达及其与肾透明细胞癌的关系( 1 ) 所有组织中均有C D C 2 5 B 蛋白的表达，肾透明细胞癌组织中呈高水平表达，并且肾癌各病理分级间的表达亦有差异，从I 级至U I I I 级随着肿瘤的分化程度降低而表达呈逐渐增加的趋势。( 2 ) C D C 2 5 B 蛋白在肾透明细胞癌组织中各临床分期中的表达也有显著差异，有统计学意义俨 7 5 为4 。
11、两结果相N 7 5 为4 。两结果相J J 1 7 5 为4 。两结果相加 2 为阴性( - ) ，2 “ 3 为弱阳性( + ) ，4 5 为中度阳性( + + ) ，6 7 为强阳性( + + + ) 。( ) ( + ) 为低水平表达，( + + ) ( + + + ) 为高水平表达；1 1 采用f 检验及秩相关法检测，P o 0 5 为差异有统计学意义。二、W e s t e r nb l o t 检测C D C 2 5 B 和1 4 3 3 0 在肾癌细胞中的表达状况。细胞离心后P B S 沈2 次，加入裂解液超声粉碎，采用B r a f o r d 法测定蛋白质浓度，电泳l j i
12、 加2x S D S 缓冲液，1 0 0 水浴1 0 分钟，6 0 9 9 蛋白进行l O S D S聚丙烯酰胺凝胶电泳：蛋白分离后，电泳转至硝酸纤维素膜，4 “ C 封闭过夜，一抗( 羊抗人1 4 3 3 01 ：1 0 0 0 ) 室温4 h ，二抗室温2 h ，采用增强化学发光法( E C L ) 显影，蛋白条带应用Q u a n t i t yO n e ( B I O R A D 公司) 软件进行灰度分析。三、C D C 2 5 Bs h R N A 瞬时转染A C H N 细胞，1 4 - 3 3 0s h R N A 瞬时转染7 6 9 P 细胞7 6 9 P 和A C H N
13、细胞置于含1 0 胎牛血清的1 6 4 0 培养基中。3 7 5 的C 0 2 ，孵箱内培养至对数生长期。用0 2 5 胰酶消化并调节细胞浓度以每孔1 0 6 个细胞接种于6 孔板中。实验分为C D C 2 5 Bs h R N A 、1 4 3 3 0s h R N A 、c o n t r o ls h R N A 组并设置正常空白对照组，s h R N A 浓度均为2 0 p m o l 。转染7 6 9 P 和A C H N 细胞方法和步骤参照脂质体说明书进行。转染4 8 h 后进行后续操作。四、W e s t e r nb l o t 确定转染效果。细胞离心后P B S 洗2 次，加入裂解液超声粉碎，采用B r a f o r d 法测定蛋白质浓度，电泳前加2x S D S 缓冲液，1 0 0 水浴1 0 分钟，6 0 9 9 蛋白进行l O S D S聚丙烯酰胺凝胶
