《Dickkopf1通过Wnt通路对卵巢癌侵袭的影响》由会员分享，可在线阅读，更多相关《Dickkopf1通过Wnt通路对卵巢癌侵袭的影响（65页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、D i c k k o p f - 1 通过W n t 通路对卵巢癌侵袭的影响T h ee f f e c to fD i c k k o p f - 1o no v a r i a nc a n c e rc e l li n v a s i o nb yr e g u l a t i n gW n ts i g n a l导一级学科：坚鏖匡堂论文课题起止时间至Q ! Q 生垒旦二至Q12 生垒月论文完成时间：2Q12 生垒旦 中国医科大学( 辽宁)2012 年5 月中国医科大学研究生学位论文独创性声明叭Y 叭2 m 0 叭9 帆帆1 5 8 1 1 帆本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师
2、指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：主丝垒日期：函Aj 毛中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通
3、讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) ，以采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：生2 整 指导教师签名：塑达窆日期：扔口工“目录一、摘要中文论著摘要( 1 )英文论著摘要( 5 )二、英文缩略语( 9 )三、前言( 1 0 0 )二、翮青”()四、论文论文一D K K - 1 在卵巢癌中的表达及意义( 1 1 )前言( 1 1 )日U 青“( 11 )材料与方法( 1 1 )实验结果( 1 9 )结论“”( 2 2 )讨论( 2 2 )论文二D K K -
4、 1 对卵巢癌细胞侵袭的影响( 2 4 )前言( 2 4 2 4 )刚舀“”()材料和方法( 2 4 )实验结果( 2 9 )结论一( 3 4 )讨论“( 3 5 )论文三D K K - 1 通过W n t 通路对卵巢癌侵袭的影响( 3 8 )前言一( 3 8 3 8 )刚舂”【)材料与方法( 3 8 )实验结果( 4 1 )结论”( 4 3 )讨论( 4 4 )五、参考文献( 4 6 )六、本研究创新性的自我评价( 5 1 )七、综述( 5 2 )八、在学期间科研成绩( 6 0 )九、致谢( 6 1 )十、个人简介( 6 2 )中文论著摘要弋卧一叭p 月秀名寥仁何干D i c k k o p
5、 f - I 通过W n t 通路对卵巢癌侵袭的影响目的卵巢癌是女性生殖道恶性肿瘤之一，其临床生物学行为特点是起病隐匿、发展迅速，诊断时超过7 0 的患者已是晚期，是病死率最高的妇科恶性肿瘤。侵袭和转移是卵巢癌的重要生物学特征之一，也是造成卵巢癌患者死亡的主要原因。近年来信号转导通路相关因子在肿瘤细胞中的作用机制，是科学工作者的研究焦点。目前研究发现W n t 通路与卵巢癌发生，发展过程密切相关。因此，探寻W n t 通路关键因子的作用机制，可为卵巢癌的诊断、治疗奠定基础。D i c k k o p f - 1 ( D K K - 1 ) 是一种分泌型糖蛋白，早期研究发现D K K - 1 与
6、多种恶性肿瘤关系密切，可以通过拮抗W n t 蛋白的活性，阻断经典W n t - B - 粘连蛋白一T 淋巴细胞特异性转录因子( T C F )传导途径，在抑制肿瘤细胞的侵袭转移过程中起着重要的作用。但近期研究发现D K K l 在不同的恶性肿瘤中生物学作用并不一致，部分研究认为D K K - 1 可能具有癌基因的特性，但其功能作用目前不清。本项目旨在研究D K K - 1 在卵巢癌中的表达作用情况，比较其与卵巢癌临床病理参数及卵巢癌预后的关系，力争寻找新的卵巢癌肿瘤标记物。同时深入研究D K K - 1 对卵巢癌细胞侵袭的影响及其作用机制，探讨卵巢癌发生、发展过程中D K K - 1 能否通
7、过W N T 信号通路促进肿瘤细胞的侵袭能力。方法1 应用r e a l t i m eR T - P C R 检测5 6 份卵巢癌、3 5 份卵巢良性肿瘤和1 2 份正常卵巢组织中D I C K 1 基因的表达，比较D K K 1 基因在不同病理程度的卵巢组织中的表情情况。2 应用免疫组化方法检测上述标本中D K K - 1 蛋白的表达分布情况，并探讨其与卵巢癌患者年龄、临床期别、细胞分化程度、组织学类型及淋巴结转移等临床病理因素以及5 年生存率的关系。在上述组织标本中，随机选取l O 份卵巢癌，5 份卵巢良性肿瘤和5 份正常卵巢组织，应用W e r s t e mb l o t 方法定量检
8、测D K 2 ( - 1 蛋白的表达情况。3 通过应用R N A 干扰技术抑制卵巢癌细胞中D K K 一1 蛋白的表达以及外源性给予D K K - 1 蛋白，构建D K K l s h R N A 基因沉默细胞模型以及D K K - 1 蛋白高表达细胞模型。应用T r a n s w e l l 细胞外侵袭实验观察D K K l 蛋白表达缺失及高水平表达前后卵巢癌细胞侵袭能力变化情况。细胞免疫荧光技术及扫描电镜技术观察D K K - 1 蛋白对卵巢癌细胞骨架以及丝状伪足的影响。4 构建D l ( 1 ( 一1 基因沉默裸鼠模型，将正常卵巢癌细胞、D K K - 1 沉默后的卵巢癌细胞接种到裸鼠
9、体内，定期观察记录小鼠体重，瘤体的大小，进一步明确D K K - 1对卵巢癌侵袭的影响。5 通过W e r s t e mb l o t 方法检测D K K - 1 蛋白表达缺失及高水平表达前后，9- c a t e n i n 蛋白，J N K l 蛋白以及P J N K l 蛋白在胞浆及胞核中表达变化情况。6 在D K K - 1 以及W n t 3 a 均低表达的卵巢癌S K O V - 3 细胞系中，同时外源性给予相同浓度的D K K - 1 以及W n t 3 a 蛋白，通过免疫共沉淀技术检测D K K - 1 与W N T 3 a 蛋白分别与W N T 经典通路L R P 一6 受
10、体的结合情况。在W n t 3 a 表达较高的H 0 8 9 1 0细胞系中，通过应用R N 干扰技术抑制卵巢癌细胞中D K K - 1 蛋白的表达，通过免疫共沉淀技术检测，D K K - 1 蛋白表达缺失前后W N T 3 a 蛋白与I E V T - J N K 通路受体F z d 3 的结合情况。结果1 、D K K 1m R N A 在卵巢癌中的表达量是J 下常卵巢组织的5 5 + 2 7 倍衅O 0 0 0 1 ) ，D K K 1r n l A 在卵巢良性肿瘤中的表达量是正常卵巢组织的1 1 4 - 0 4 倍，但无统计学差异( 尸= o 4 8 6 ) 。2 、免疫组化结果表明D
11、 K K 1 蛋白在J 下常卵巢组织中的表达率为5 8 3 3 ( 7 1 2 ) ，在卵巢良性肿瘤组织中的表达率为6 5 7 1 ( 2 3 3 5 ) ，在卵巢癌组织中的表达率为8 9 2 9 ( 5 0 5 6 ) ，D K K 1 蛋白在卵巢癌组织中的表达明显高于卵巢良性组织( z 2 = 7 5 4 2 ，P = 0 0 0 6 ) ，及正常卵巢组织( Z 2 = 6 9 8 2 ，P = O 0 0 9 ) 。D K K - l 在卵巢良性组织中的表达与正常卵巢组织比较无明显差异，( 贮= O 2 1l ，P = O 6 4 6 ) 。D K K 1 蛋自在卵巢癌F I G O 晚
12、期( I I I 、I V 期) 的强阳性表达率明显高于早期( I 、2n 期) ，( 8 0 V S4 2 31 ；X2 - 8 4 4 3 ，P = O 0 0 4 ) ：在低分化肿瘤中的强阳性表达率明显高于高、中分化肿瘤( 7 5 V S4 0 ；x2 = 6 7 2 0 ，P = O 0 1 0 ) ；但D K K 1强阳性表达率与卵巢癌组织学类型和患者年龄以及淋巴转移无明显相关( P o 0 5 ) 。D K K - 1 高表达的卵巢癌患者的五年生存时间明显低于D K K 1 弱表达及表达阴性的卵巢癌患者( 3 6 0 0 士1 0 0 0 5v s7 0 0 0 4 - 2 1 9
13、 1 月，P 7 5 ，4 分，二者得分相乘) 。O 4 分为阴性，5 8 分为弱阳性，9 1 2 分为强阳性。( 三) W e s t e r nb l o t 检测组织D K K 1 蛋白的表达1 、组织蛋白的提取1 0 0 m g 组织剪碎，经磷酸缓冲液( P B S ) 冲洗2 3 次l加入3 0 0 l al 细胞裂解液( R I P A ) ，匀浆磨碎l1 5冰浴3 0 m i n4 “ C ，1 2 0 0 0 r p m 离心5 m i nl提取上清于一新1 5 m l 管中，考马斯亮蓝法测定样品蛋白浓度，- 7 0 c 保存2 、蛋白质定量( B r a d f o r d 法)按照每管3 m l 考马斯亮蓝G 2 5 0 染液( O 4 9 考马斯亮蓝G 2 5 0 ，1 0 0 m 1 9 5 E t h a n o l ，2 0 0 m 1 8 5 H 3 P 0 4 加去离子水至2 0 0 0 m l ，过滤保存) 、21 tl 样品、9 8 | ll 去离子水配制液体；对照组为：3 m l 考马斯亮蓝G 2 5 0 染液、2I IlR I
