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1、方法为结核分支杆菌复合群特异，灵敏度可达一个M t b 菌体。国内学者顾德林等对3 6 株耐利福平临床分离M t b 作了r p o B n P C R 与测序研究，发现3 4 株存在突变”。高灵敏的r p o B n P C R 技术使得部分菌阴结核病病人痰标本中少量M t b 菌( f 氐于B A C T E C 可培养下限) 或死M t b 菌存在检出的可能性。本组研究对象获得了3 5 8 ( 3 9 1 1 0 9 ) 的检出率，即三分之一左右的菌阴结核病病人得到了实验室客观指标的确认对2 2 例r p o B n P C R 阳性产物D N A 测序发现9 例存在r p o B 基因
2、突变，该9 例中7 例为复治病人：本研究提示r p o B n P C R 与测序技术现阶段可作为B A C T E C 培养诊断结核病和利福平耐药的补充手段。志谢：本研究承蒙原无锡市肺科医院结核科虞永鑫提供部分材料。参考文献1 糜祖煌，秦玲。结核分支杆菌3 种不同靶基因传统P C R 、巢式P C R 检测比较研究中国优生与遗传杂志，2 0 0 2 ，1 0 ：2 8 3 02 曹哗，秦玲。结核分枝杆菌r p o B 基因的套式P C R 扩增及其D N A 测序上海医学检验杂志，2 0 0 0 ，1 5 ：1 7 4 - 1 7 53 顾穗林，刘书林，施军卫，等。结核分枝杆菌r p o B
3、 基因突变的测序研究临床检验杂志2 0 0 2 ，2 0 ：9 4 - 9 54Y a nW C Y u e nK Y ，s e t oW H D i r e c td e t e c t i o no fm y c o b a e t e r i u mt u b e r c u l o s i si nr e s p ir a t o r ys p e c i m e n su s i n ga na u t o m a t e dD N Aa m p l i f i c a t i o na s s a ya n das i n g l et I l b en e s t e dp o
4、l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o nC l i nC h e u nL a bM e d ，1 9 9 8 ，3 6 ：5 9 7 5 9 95 陈志敏，汪天林，张在珍。基因扩增结合探针杂交和巢式聚合酶链反应检测痰结核分支杆菌的比较研究中华结核和呼吸杂志，1 9 9 8 ，2 1 ：3 9 86 马鸿达，朱钧张乃鑫，等。结核分支杆菌D N A 的单管巢式聚合酶链反应检测中华结核和呼吸杂志，1 9 9 8 ，2 1 ：3 9 9 3 4 07 马路，苗灵娟，覃松石等。巢式聚合酶链反应检测支气管内膜结核患者活检组织中结核分支杆菌中华结核和呼吸杂志，1 9
5、9 9 2 2 ：1 4 5 1 4 6E S B L s 基因型及其检测方法糜祖煌综述泰玲审校无锡市克隆遗传技术研究所2 1 4 0 2 6超广谱B 一内酰胺酶( E x t e n d e d S p e c t r u mB L a c t a m a s e s ，E S B L s ) 是指由细菌质粒介导的能水解氧亚氨基1 3 一内酰胺抗生素，并可被1 3 一内酰胺酶抑制荆( 如克拉维酸) 所抑制的一类酶”1 。随着p 一内酰胺抗生素的过度使用和泛用，能产E S B L s 的细菌种类不断增加，具E S B L s 表型的基因种类也不断增加。本文就常见的E S B I s 基因型及其
6、检测方法作厄要综述。1T E M 型E S B L s广谱B 一内酰胺酶T E M 一1 最初是从希腊1 名叫T e m o n i e r a 的病人血培养中分离到的大肠埃希菌中发现，并得以命名。T E M 型E S B L s 是在T E M I 型基因序列的基础上由一至数十个氨基酸的密码予突变而成。如今T E M 命名已至T E M 一11 9 型。其中T E M - 2 、T E M 一1 3 、T E M - 5 6 、T E M - 5 7 与T E M - 1 一样为广谱酶；而T E M - 3 0 、一3 1 、一3 2 、一3 3 、一3 5 、“、一5 9 、- - 6 5
7、 、一7 3 、0 4 、一7 6 、- 7 7 、0 8 、一7 9等并能耐酶抑制剂，称耐酶抑制剂T E M ( i n h i b i t o r - r e s i s t a n tT E M ，I R T ) ，也称耐酶抑制剂B 一内酰胺酶作者简升：糜祖煌1 9 6 2 年出生男。研究员。从事分子截钫学研究。以发表论文1 0 0 余篇。5 4 4 ( i n h i b i t o r r e s i s t a n tB l a c t a m a s e s ，I R B L s ) 。T E M 型E S B L s 主要从大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中发现，其他肠杆菌科和铜绿假单
8、胞菌中也有发现。T E M 基因型及亚型检测最初以P C R 扩增和寡核苷酸探针杂交的手段8 1 。后因发现的亚型不断增加此方法已不能检出全部亚型和发现新的亚型。人们改用T E M 全基因P C R 克隆测序或直接测序。我们根据T E M 基因保守区序列自行设计了T E M P - ( 5 一A T A ，A 从， T F C ，T r G ，A A G ，A C G ，“A 一37 ) 、T E M P 2 ( 5 一G A C ，A G T ，T A C ，C A A ，T G C ，T F A ，A T C ，A 一3 ) 、T E M P ，( 5 一A G G ，A A G ，A G
9、 T ，A T G ，A 1 T ，C A A ，C A 一3 ) 、T E M P , ( 5 一C T C ，G T C ，( ；T T ，T G G ，T A T ，G G C 一3 ) 4 条引物。先以T E M P ，- T E M P ：扩增，然后分别再以T E M P - T E M P , 、T E M P ，- T E M P ：作重叠的半套式扩增。后二者产物分别作正向和反向测序并由计算机拼接出T E M 全基因序列。采用本法国内苏州大学儿童医院已发现1 株具E S B L s 表型，基因型为启动子区有一碱基突变的T E M 一1 型o ；山东大学公共卫生学院则发现了T E
10、M 型E S B L s 洛菲不动杆倒1 。2S H V 型E S B L sS H V 型E S B L s 有水解头孢噻吩的巯基作用。S H V 是巯基变量( s u l p h y d r y lv a r i a b l e ) 的缩写。S H V型E S B L s 是在广谱酶S H V 一1 型基因序列的基础上由一至数十个氨基酸的密码子突变而成。如今S H V命名已至S H V J , 5 型。其中S H V 一1 1 、S H V 一1 4 、S H V - 2 5 与S H V 一1 一样为广谱酶。S H V 型E S B L s 主要从肺炎克雷伯菌中发现。另外，差异枸橼酸杆菌
11、、大肠埃希菌和铜绿假单胞菌中也有发现。我们根据S H V 基因保守区序列自行设了S H V P I ( 5 一T C G ，G C C ，T I C ，A C T ，C A A ，G G A ，T G 一3 ) 、S H V P ：( 5 _ T C C C G C A G A ，T A A ，A T C A C C ，A 一3 ) S H V P 3 ( 5 一G G T ，T A T ，G C G ，1 T r A ，T A T ，T C G ，C C 一3 ) 、S H V P 。( 5 一7 r r A G C G ，T F G ，C C A ，G T G ，C T C 一3 ) 4
12、条引物。先以S H V P t - S H V P 2扩增，然后分别再以S H V P ，一S H V P , 、S H V P 3 一S H V P 2 作重叠半套式扩增。后二者产物分别作正向和反向测序并由计算机拼接出S H V 全基因序列。采用本法国内解放军9 8 医院发现了S H V 型E S B L s 的鲍曼不动杆菌和T E M + S H V 型E S B L s 的鲍曼不动杆菌。3C T X M 型E S B L S C T X M 型E S B L s 主要对头孢噻肟( C T X 洧高水解活性。我国有较高的检出率。T O H O 一1 和T O H O 一2型为日本T o h
13、 0 大学学者发现，是日本常见的E S B L s 型。T O H O 与C T X M 型E S B L s 基因序列高度同源，现已归人C T X M 型。因C T X M 各亚型间基因序列差异较大，检测需根据其序列的同源性分三组完成。C T X M 9 、一1 3 、一1 4 、一1 6 1 9 和T O H O - 2 型可用引物( 5 一A G T ，G C A ，A C G ，G A T ，G A T ， G T 一3 ，和5 ，一G G C ，T G G ，G T A ，A 从，T A G ，G T C 一37 ) 进行P C R 扩增检测；C T X - M 2 、- 4 一7和
14、H O H O I 型可用引物( 5 A C G ，E T A ，C C C ，C T G ，C T A ，T Y 一3 和5 - C A G ，A A A ，C C G ，T G G ，G e r ，A C G ，A 一3 ，) 进行P C R 扩增检测；C T X M I 、一3 、一1 0 一1 2 、一1 5 型可用引物( 5 一A C G ，C T G T r G ，T r A ，G G A A G T ，G 一3 和5 一T r G ，A G G ，C T G ，G G T ，G A A ，G T 一37 ) 进行P C R扩增检测”。区分亚型需将扩增产物作正反向测序。大肠埃希菌、
15、肺炎克雷伯菌是常见的产C T X M 型E S B L s 菌。4O X A 型E S B L sO X A 型1 3 一内酰胺酶主要水解苯唑西林( O X A ) 。已发现的4 0 余种O X A 型p 一内酰胺酶中有1 4种属E S B L s ，它们分别为O X A 一1 、- 2 、一1 0 、一1 1 、一1 4 一9 、- 2 8 、- 3 1 、一3 2 、一3 5 。其中O X A i 0 曾命名为P S E - 2 。O X A I i 、一1 4 、一1 6 对头孢他啶( C A Z ) 有高水解活动性。O X A 型E S B L s 主要发现于铜绿假单胞菌中，大肠埃希菌
16、也有发现。我们以引物( 5 - G T C ，7 兀T r ，C G A A ，G T A ，C G G ，C A T ，T A 一3 ，和5 ，一G A T ，T I r ，C T Y ，A G C ，G G C ，A A C ，r r A _ 3 ) 可扩增该二种菌中的O X A 基因。区分亚型需将扩增产物作正反向测序。 5 其他类型E S B L sT E M 、S H V 型E S B L s 呈全球性分布，另有一些呈区域性分布的E S B L s 。如B E S 型E S B L s ( B r a z i lE x t e n d e d - s p e c t r u mB l a c t a m a s e s ) 是从巴西粘质沙雷菌中发现”。V E B 型E S B L s ( V i e t n a m a s e5 4 5 E x t e n d e d s p e c t r u m
