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1、的细胞处于棱移植供体细胞所要求时相。体细胞克隆胚胎移植获得妊娠。5B 超技术B 超妊检牛1 3 5 5 头次，羊5 5 0 余侧，建立了牛、羊B 超妊检方法。B 超用于早孕诊断、性别鉴定，从而进行选择性淘汰，提高繁殖率，增加母犊率。对母牛卵巢状态、卵泡发育波出现和持续的时间等追踪观察进行了一系列试验。可提供卵泡、黄体的动态变化，B 超检测为鉴定发情、适时开展同期发情、超数排卵和人工授精提供了可靠的依据。除用于活体取卵，体外生产胚胎外，B 超技术还用于卵巢囊肿等子宫卵巢疾病的诊断，效果明显。7 结语随着畜牧科学技术的不断发展，将动物胚胎工程技术应用于家畜繁殖和育种生产中，将对畜牧业的发展，尤其是
2、养牛业的发展起到无可估量的作用，并产生极其深远的影响。法国克隆牛研究进展：克隆牛的畜牧学性能与健康状况易建明( 华中农业大学，湖北武汉4 3 0 0 7 0 )摘要：1 9 9 8 年第一头体细胞克隆牛的出生，在美国与法国几乎是同时。法国I N R A 自1 9 9 8 年至2 0 0 5 年，对体细胞克隆牛的畜牧学性能与健康状况等做了系统的研究，本文综述和介绍了这些研究的主要进展。克隆技术可能应用于牛的遗传改良和基于转基因技术的生物医药。以生产出的成活后裔计，这项生物技术的总效率目前仍然较低。但近年来，在这项技术的每一环节上均取得可喜的进展。当然，由体细胞棱移植生产出的牛囊胚有一个缺陷，就是
3、以某些特征为标志的“克隆征候群”，这包括在胚胎附植期前后发生的胚胎损失和妊娠后期观察到的胎儿损失，及L O S ( L a r g eO f f s p r i n gS y n & o m e ) 综合症。约6 0 一7 0 的克隆犊牛能正常成长至成年且生理上表现正常。最近关于体细胞克隆公母牛的研究结果表明，它们与非克隆牛的畜牧学性能相似，并且能够正常的繁殖，它们的后裔没有那些与克隆牛有关的病理现象。因而我们可确信，在克隆牛上所观察到的一些异常是外遗传的，不传递给后代。由核移植技术生产克隆动物的数量在世界各国正在增长，尽管其效率目前仍不高。这使得从高价值的母牛和公牛获得成活的表型上正常的动物
4、成为可能。这开辟了在动物育种业上挽回后裔测定证明为卓越的但受伤而不能再生产精液的公牛种质的可能。同样的，具有稀有表型与高遗传价值的母牛或濒危品种能被成功地从多种类型的体细胞克隆出来，甚至从一头死亡的动物克隆出来。I N R A 自1 9 9 8 年至2 0 0 5 年，对体细胞克隆牛的畜牧学性能与健康状况等做了系统的研究，本文就这些研究的主要进展向同行做一介绍。l 动物克隆技术“克隆”可定义为，来源于同一亲本的无性繁殖的两个或两个以上的一组遗传结构上相同的个体。克隆这个术语常被用于由核移植技术生产动物这个过程或生产出的动物。在这项技术中，供体细胞( 核质体) 被移植至遗传物质被移去的受体细胞(
5、 胞质体) 。实际上，克隆牛生产的全过程还要包括将体外生产出的克隆胚胎移植给受体牛，生产克隆牛。以下为采用核移植技术生产克隆牛的示意图。a ) 供体动物 b ) 供体细胞培养c ) 成熟的卵母细胞订魅籼曲胚r d ) 卵母细胞去棱+ e ) 核移植+ f ) 细胞融合+ g ) 克隆胚胎的发育图i 动物克隆技术的各环节2 生长发育与繁殖据H e y m a n 等( 2 0 0 4 ) 等的报导，它们比较评估了在同一牧场克隆的一组荷斯坦小母牛与人工授精的小母牛的生长发育情况，也实验研究了一组克隆公牛和它们的精液特性。克隆组的出生重在统计上显著地高于由A I 获得的同期对照组小母牛；但生长速度还
6、是处在荷斯坦小母牛的正常范围内( O 7 一o 8 k 罄) ，也不受高或低出生重的影响。在同一克隆的个体内，日增重的差异比其对照的差异小。从3 头克隆公牛获得的精液的产量数据来看( 表1 ) ，在同龄小公牛参数的正常范围内。本研究还做了一项在供体公牛冻精和它的3 头克隆形态学分析的直接比较( 表4 ) 。精液的总体状况在可接受的范围内，克隆公牛表现出与供体相似的精予畸形率( 8 0 形态正常的精子) 。这些初步的结果表明，克隆对克隆公牛的精液性状无不良影响。将一头克隆公牛的冻精用于A I 试验，妊娠率为6 5 ，正常分娩2 5 头活犊。对于两性别克隆牛的后裔，出生第一周的表现与医学的观察未发
7、现任何异常，这表明在克隆牛间观察到的变异不传递给后裔。据两性别克隆牛有限的数据看出，显然当克隆牛长大至成年时，它们具有与非克隆牛相似的性能。对克隆公牛，在性成熟、精液产量、精液形态学、总繁殖力，无论是体外和体内，尽管最后一项指标仅监测了一头均未观测到差异( 表1 一表4 ) 。关于两性别克隆牛的后裔，出生第一周的表型与医学的观察表明没有任何异常，这表明在克隆牛间观察到的变异不传递给后裔，这如在小鼠上通过克隆公鼠与母鼠间的杂交试验已表明的那样。这被克隆的小母牛与克隆的公牛相配出生健康的犊牛所证实。 表1 从搬m 克隆牛的精液产量M t o t o克隆1克隆2O 8O 4O 49 0 58 6 ，
8、78 2 32 4 62 3 11 5 7塞堕! ：!墅：!一盟蔓一2 7 8 全国养牛科学研讨会文集养牛科学技术研究进展表3M t o t o 和它的克隆的细管冻精用于体外受精胚胎发育的情况3 泌乳特别是在美国，一些开展克隆牛研究的公司对克隆奶牛的乳产量进行了评估。他们做了从胚胎分割或N 1 1 所生的荷斯坦克隆牛泌乳性能( 产乳量、脂肪、蛋白) 平均遗传水平与同品种群体平均水平的比较。乳成分是一项被关注的问题，特别是在生物技术的食品安全方面。在最近的一项研究中，他们分析从由胎儿或体细胞和不同种系的细胞所得的克隆牛的1 5 个泌乳期的奶样中的总干物质、脂肪、脂肪酸、乳糖和总蛋白含量，把这些数
9、据与另一牧场的非克隆牛的牛乳进行了比较。结果显示，总体的化学成分相似。然而，乳成分受许多因素的影响( 遗传来源、营养的、管理的) 。在他们的实验牧场，进行了一项试验以比较不同系列克隆牛与饲养在同样条件下的对照组母牛的乳产量。对照组是同期的由同一公牛采用A I 所生的荷斯坦母牛。依据法国的现行法律，产白克隆牛的乳要弃掉，不能用于人和动物消费。法国的试验比较了母牛第一泌乳期的乳产量，3 头同一基因型的克隆母牛的初步结果表明，它们的乳产量正常( 3 0 5 的乳产量为9 3 4 1 4 - 3 0 4 1 ( ；) ，且较3 头同样双亲来源的对照A I 母牛更均一( 3 0 5的乳产量为8 3 1
10、94 - 1 8 0 0 k g ) 。克隆牛与对照的泌乳曲线也相似。无论是在乳成分或体细胞计数方面均无显著差异。克隆牛与对照牛3 0 5 d 的乳蛋白产量分别为3 2 14 - 2 2 k g 和2 6 5 5 0 k g ；同期的乳脂产量分别为3 2 14 - 2 2 k g 和3 3 0 4 - 5 2 b 。克隆牛的乳蛋白量与乳脂量的标准差亦小于对照牛，表明r 克隆牛间更高的遗传同质性。另外，每月体细胞数的测定结果克隆牛与对照牛的平均体细胞数分别为1 1 6 1 0 3x 1 0 3 与1 1 3 5 0x 1 0 3 ，表明所有试验牛均无乳炎。养牛科学技术研究进展全国养牛科学研讨会文
11、集2 7 9春 斟壮 昧摹粘鐾 降 蛙 瞽馁 塔 蛙 吐 忙聒童 艇 寤暑昙s翻苫詈。三S 函釜盆 宴懈 乜 i。誉誉。兰詈詈。寸oq o崞。一IN o寸。口oq oo 啦啦口c 口一岫n 趟避N 髓斌_ 【趟慑。盛薹# 啦壮昧雅讯毒暴散艇悻七K壮蜷聒水岛辞牵州悻诬越蛰隶船昧静嚣齄郴羁f 禚妊球器水竹冀(冰一址耱卸谦目蠹亭o S，Ro 豁，磊，_ 【o _ 【叶。寸oo _ 【o Ioo ，一n No 寸H，【m 懈粘肖嚣辐醛卜嚣米繇娟粗球器避蛊释蝌雹辨蟥辅氍蜂銎一枣址耱蝴龌耩删槲靶一辎，赳昏睾隶卅怡龄器挺瓣驻再埒定廿窜世憾目僻4 克隆牛妊娠后期期损失在他们的这项研究中，比较了采用不同的细胞系
12、( 成牛体细胞，胎儿体细胞，早期胚胎细胞) 投移植后产生的牛克隆胚胎移植给受体后的体内发育情况，I V F 组作为对照( 表5 ) 。在妊娠期的9 0 d 至产犊时损失的发生率在成年体细胞克隆组和胎儿体细胞克隆组分别为4 3 7 和3 3 3 ，而在胚胎克隆组仅为4 3 ，在体外受精对照组为0 。表5 牛克隆胚胎移植后的体内发育F i g u r e2 是由表5 做成的直观柱形图。P r e g n a n c yr a t eF i g u r e2 E v o l u t i o no fp r e g n a n c yp r o f i l e si nb o v i n er e c
13、 i p i e n t sa f t e rt r a n s f e ro fc l o n e de n l b r y o s 5 不同年龄克隆牛的健康状况通过体细胞克隆能够生产具有正常生育力的后裔的技术业已建立。N T 胚胎的一个特点是妊娠期损失的发生率高，损失主要发生在妊娠早期和后期及围产期。在牛和羊，大部分损失发生在妊娠前三分之一的时期。最近的研究表明，这可能与胎盘血管化缺陷有关，也可能与胎盘上的主要组织相容性复合体组I 抗原表达的紊乱有关。有试验报道妊娠后期的L O S 现象，是某些培养条件下I V F胚胎和克隆胚胎围产期死亡的重要原因。在L O S 例，后期的损失与胎儿体格过
14、大、异常的胎盘发育( 尿囊水肿) 、子叶水肿增大数量减少、不同步的器官生长有关。体细胞克隆L O S 的发生率高于胚胎细胞克隆，各类克隆胚胎高于F 生产的胚胎。在羊上有关的研究表明，在受影响的I V F 生产的胎儿中，I G F 结合蛋白的表达有改变，I G F R 2 被抑制，因而证实了一些研究者的推测，印记过程被扰养牛科学技术研究进展全国养牛科学研讨会文集2 8 1乱。克隆牛的妊娠期通常较长，仅7 0 的胎儿出生后能成活。目前还不十分地清楚那些成活的克隆牛是否是完全地正常，是否它们会更快的衰老，因在大多数情况下，特别是在奶牛，长寿性是很重要的。体细胞克隆的程序与重要的妊娠期和围产期损失有关
15、，常常使得体细胞克隆的效率降至5 以下。平均有3 0 的克隆犊牛在6 月龄前由于多方面的病理原因死亡，最常见的有呼吸衰竭、异常的肾发育、肝的脂纺变性等。与体重的增长相关联，心脏与肝脏的重量亦增加。成活者虽然大多数临床上表现正常，但与由A I 得到的对照组牛在头1 2 月龄内有所差别，而在这之后就变得不可区分。如H b 的含量较低，而瘦蛋白( k p l i n ) 的含量较高。一项长期得观测计划正在I N R A 开展，1 年多的初步结果表明，在血液学指标方面各组问没有统计学上的差异( C h a v a t t e P a l m e r 等，2 0 0 4 ) 。表61 9 9 8 年来出
16、生的5 9 头体细胞克隆牛的成活率* 据C h a v a t t e P a l m e r 等，2 0 0 4参考文献H e y r n a n ，Y ，e ta l ，2 0 0 5 ，R e p r o d N u t r D e v 4 5 ，3 5 3 3 6 1H e y r n a n ，Y ，e ta l ，2 0 0 4 ，Q 酶S t e mC o i l ，6 ，I I I 1 2 0H e y m a n ，Y ，e ta l ，2 0 0 2 ，B i o lR e p r o d ，6 6 ，6 1 3C h a v a t t e P a l m e r ，e ta l ，2 0 0 4 ，C l o n i n gS t e mC e l l ，6 ，9 4 1 0 0Y IJ i a n m i “g ，P r o f C o l l e g eo fA n i m a lH
