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1、牛蒡皮绿原酸提取纯化及其对高脂血症大鼠作用研究牛蒡皮绿原酸提取纯化及其对高脂血症大鼠作用研究东南大学硕士学位论文牛蒡皮绿原酸提取纯化及其对高脂血症大鼠作用的研究姓名:徐庭鑫申请学位级别:硕士专业:营养与食品卫生学指导教师:马永建200906031 中文摘要中文摘要牛蒡皮绿原酸提取纯化及其对高脂血症大鼠作用的研究硕士研究生姓名:徐庭鑫 导师姓名:马永建主任技师 毕业学校:东南大学目的: 分析牛蒡皮的主要成分; 研究提取牛蒡皮绿原酸的最佳工艺条件,得到牛蒡皮绿原酸提取物; 优化牛蒡皮绿原酸提取物分离纯化的方法条件,制备出纯度较高的牛蒡皮绿原酸: 了解牛蒡皮绿原酸提取物能否改善试验大鼠的脂代谢紊乱状
2、态;了解牛蒡皮绿原酸提取物能否改善试验大鼠的氧化应激状态:通过对高脂血症大鼠代谢组学的研究,探索能够表征高脂血症发生、发展和恢复状态的生物标记物。方法: 采用传统植物化学物定性鉴定方法确定牛蒡皮中可能含有以及不含的植物化学物。 选用酸水提取法提取牛蒡皮绿原酸,在单因素试验的基础上,设计正交优化试验,以提取率最高的条件来提取制备牛蒡皮绿原酸。通过预试验以及吸附特性,选取 大孔吸附树脂对牛蒡皮绿原酸提取物进行分离纯化,探索较好的分离纯化条件,得到纯度较高的牛蒡皮绿原酸。 试验大鼠分为阴性对照组、高脂模型组、牛蒡皮绿原酸提取物低剂量组和牛蒡皮绿原酸提取物高剂量组个组,除阴性对照组外其余各组均饲以高脂
3、饲料,受试物各组分别给予受试物牛蒡皮绿原酸提取物、/?灌胃。连续喂养周,测定各组大鼠体重、甘油三酯、胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、谷胱甘肽过氧化物酶?、超氧化物歧化酶、丙二醛。 以超高效液相色谱.四,级杆飞行时间质谱./为核心技术,以主成分分析法为数据分析手段,研究阴性对照组、高脂模型组和牛蒡皮绿原酸提取物高剂量组大鼠血浆中代谢物组的变化和对应关系,找出其中可能的生物标记物。结果:通过定性实验证实,牛蒡皮中可能含有生物碱、黄酮类化合物、三萜类化合物以及酚类物质,不含糖、甙以及醌类物质。 单因素试验结果表明:最佳提取工艺参数为盐酸浓度%,料液比:,提取时间,提取温度,碎度目,提取次。正交试验结果表
4、明,影响绿原酸酸水提取的主要因素为破碎度,其次为液料比、提取次数以及溶剂浓度。最佳提取工艺条件为,即破碎度目,料液比:,以.%盐酸水溶液提取次,每次,绿原酸的得率约为.%。此条件即为提取牛蒡皮绿原酸的最佳条件。大孔吸附树脂可以有效地分离、纯化出粗提物中的绿原酸。在.的层析柱上样,以蒸馏水冲洗,并以%乙醇进行洗脱,收集洗脱液,在此条件下可获得纯度为.%的绿原酸。动物实验结果表明,与高脂模型组相比,牛蒡皮绿原酸提取物能降低高脂大鼠、水平,升高血浆这一保护性因子水平,并且能够提高、.活性,降低水平,效果以牛蒡皮绿原酸高剂量组最为明显,而且从结果来看,其降脂以及抗氧化的效果均较好。对血浆中小分子成分的
5、鉴别比较表明,牛蒡皮绿原酸提取物高剂量组、阴性对照组以及高脂模型组间存在差异。结论:酸水提取法,虽然不是新型的提取方法,但与常规水提法相比,具有高效的优点;与醇提法2 东南大学硕士学位论文相比,提取效果相差不大,但可以避免大量有机溶剂的使用,可以减少有机污染,有广阔的发展前景。试验证实其适合提取牛蒡皮中的绿原酸,最佳提取工艺条件为:破碎度目,料液比:,以。%盐酸水溶液提取次,每次,绿原酸的得率约为.%。大孔吸附树脂可以有效地分离纯化粗提物中的绿原酸,最佳条件为:在.的层析柱上样,以蒸馏水冲洗,并以%乙醇进行洗脱,收集洗脱液,在此条件下可获得纯度为 .%的绿原酸。大孔吸附树脂可以较好地分离纯化牛
6、蒡皮粗提物中的绿原酸,该树脂的吸附特性适合分离牛蒡皮中的绿原酸,可得到较高纯度的牛蒡皮绿原酸,为进一步的功能试验奠定了基础。 牛蒡皮绿原酸提取物对大鼠高脂状态具有良好的调节作用,同时对高脂大鼠的氧化应激状态具有良好的调节作用,具体机制有待进一步的研究。 发现牛蒡皮绿原酸提取物高剂量组、阴性对照组以及高脂模型组血浆中的小分子成分存在差异,但是具体物质的鉴定工作尚需进一步的试验。关键词:牛蒡皮;绿原酸:提取:纯化;高脂血症:代谢组学3英文摘要英文摘要: : . . . ,.: . 行, , , , . ”. : , , /。 /。蚝。.? %,%, .,%. . ,.?, ?/.: , 、 、 、
7、, .,4东南大学硕士学位论文 . 舔? . : 。 :, .%. , . %. .雏:. %,. 。 .%.鹤勰, ,?. ./ ,: .,部: ,? :, .%. . .%. . . .%. .觞硒, ?. .,:; ;5中英文缩略词中英文缩略词绿原酸电喷雾离子源. 气相色谱质谱连用. 谷胱甘肽过氧化物酶? 高密度脂蛋白胆固醇 高效液相色谱法丙二醛核磁共振光谱仃单向方差分析. 正交偏最乘聚类分析?主成分分析法偏最乘聚类分析 超氧化物歧化酶胆固醇甘油三酯超高效液相色谱.四级杆?/一飞行时间质谱 6东南大学学位论文独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究
8、成果。尽我所知,除了文中特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果,也不包含为获得东南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名:妊绫魄斟址东南大学学位论文使用授权声明东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档,可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外,允许论文被查阅和借阅,可以公布包括以电子信息形式刊登论文的全部内容或中、英文摘要等部分内容。论文的公布包括以
9、电子信息形式刊登授权东南大学研究生院办理。一虢燃一名盟皿期:平7 前言前言随着我国社会经济的发展、膳食结构和生活方式的改变,以及人口城市化、老龄化的变化,慢性非传染性疾病迅速上升,已成为我国越来越严重的公共卫生问题。心脑血管疾病是其中重要的慢性病之一,是危害人类健康的第一大杀手,排在恶性肿瘤和其他慢性疾病的前面。心脑血管疾病不但对人们的生命健康造成重大危胁,而且给社会带来沉重的经济负担。西苏格兰冠心病预防研究中心报道,胆固醇降低%,低密度脂蛋白降低%,冠脉事件减少致死性或非致死性中风的危险度降低%。所以积极控制高脂血症,是防治心脑血管疾病的有效措施。然而,目前的中成药在治疗心脑血管疾病中的疗效
10、和副作用仍然受到很大的争议,因此,寻求具有调节血脂功能的天然成分成为目前的焦点。牛蒡 .属菊科牛蒡属,其种子、根、叶在民间被广为应用。干燥成熟果实牛蒡子为历版中国药典收载,具有疏散风热、宣肺透疹、解毒利咽之功效,用于风热感冒、咳嗽多痰、麻疹、风疹、咽喉肿痛、痄腮丹毒、痈肿疮毒等型】;单味牛蒡子可治疗氯氮平所致便秘和流涎【、习惯性便秘【】和扁平疣【】;牛蒡子方剂可治疗腰椎间盘突出症术后症状、偏头痛【】 、老年打鼾【和周围性面神经麻痹等症;牛蒡根可用于治疗伤暑、疥疮,将其炖鸡、炖肉服用可治虚弱脚软无力;牛蒡叶含抗菌物质最多,水煎当。茶,可治急性乳腺炎其中,牛蒡根的水提物【以及有机溶剂提取物均具有抗
11、氧化活性,能清除自由基和活性氧。牛蒡根水提物具有提高大鼠肝组织和血浆中活性,降低机体水平,减轻细胞损伤的作用【 ,有研究显示绿原酸具有抗氧化的功效【,同时有研究显示牛蒡皮提取物中绿原酸的含量明显高于牛蒡根【幅,但目前国内外关于牛蒡皮提取物降脂作用的研究基本没有【,牛蒡皮仍旧被当作废弃物丢弃掉。因此,在优化的条件下对牛蒡皮绿原酸进行提取纯化,得到产率、纯度都相对较高的绿原酸提取物,进一步对其做功效试验研究,对探讨某些病理生理状态的影响及可能机制具有重要意义。基于上述情况,本试验旨在研究牛蒡皮绿原酸提取物对高脂状态下血脂水平的影响,考察牛蒡皮绿原酸提取物是否具有改善脂代谢的生理功能,并探索其可能的
12、作用机制。研究分为两部分:第一部分为牛蒡皮绿原酸的制备及主要成分分析,包括提取、分离纯化;第二部分为功效试验部分,即牛蒡皮绿原酸提取物对脂代谢紊乱的影响及机制研究,包括动物试验以及可能生物标记物的探索。本次研究的意义在于考察牛蒡皮绿原酸提取物对血脂代谢的影响,初步探索牛蒡皮绿原酸提取物改善血脂水平的可能机制,从而为开发利用药食两用植物中植物化学物的功效成分提供依据,一方面发掘出具有改善血脂药理作用的天然植物功效成分,另?方面为科学开发、有效利用废弃的丰富的牛蒡皮资源来改善人们健康状况提供试验依据。8 东南大学硕士学位论文第一章牛蒡皮主要成分分析及绿原酸提取纯化第一节牛蒡皮主要成分分析目前关于牛
13、蒡皮化学成分的研究在国内外尚未报道,本研究主要通过常规植物化学物定性鉴定方法确定牛蒡皮中所含有的主要植物化学物,对后续的提取纯化工艺有一定的参考意义。.材料与仪器牛蒡皮徐州丰县牛蒡生产基地;电子天平奥多利斯;标准筛浙江上虞市道墟张兴沙筛厂;未说明的试剂均为分析纯;.方澍】.生物碱的鉴定.原理大多数生物碱能和某些酸类、重金属盐类以及一些较大分子量的络盐反应,生成单盐、络盐或者不溶性复合物沉淀。这种能与生物碱产生沉淀的试剂称为生物碱沉淀剂,而碘化铋钾则是其中的一种。如果含有生物碱,在遇到碘化铋钾溶液时会产生红棕色沉淀。.碘化铋钾试剂的制备溶液:.次硝酸铋溶于冰醋酸后加入蒸馏水:溶液:碘化钾溶于水中
14、;溶液、等体积混合,置于棕色瓶中保存。.生物碱定性鉴别方法取生药,用粉碎机粉碎后过目标准筛得生药粉末,称取,用%醇。水浴热提次/次,一次,合并提取液,旋转蒸发仪挥干乙醇,浓缩液滴加 %盐酸,过滤,一张滤纸上滴加少量过滤液,另一张滴加少量蒸馏水作空白对照,然后两张滤纸均滴加碘化铋钾试剂。.黄酮类化合物的鉴定.原理黄酮类化合物溶液滴于滤纸上,干后暴露于氨气中,能使黄酮、黄酮醇类转为亮黄色,放置后颜色可因氨气挥发而褪色,变色是可逆的。.黄酮类化合物定性鉴别方法称取生药粉末,用 %乙醇。水浴热提次,取几滴提取液滴于滤纸上,待其干后暴露于氨气中。空白对照将提取液换成蒸馏水,其它步骤相同。.皂甙的鉴定.原
15、理样品溶于氯仿,加入浓硫酸,氯仿层出现红或者青色。.皂甙定性鉴别方法9第一章牛蒡皮主要成分分析及绿原酸提取纯化称取生药粉末,置于氯仿中提取后,取提取液,均加入.浓硫酸。空白对照管将提取液换成蒸馏水,其它步骤相同。.糖以及甙类的鉴定.原理.萘酚试剂试剂反应:利用糖、多糖以及甙在浓硫酸和一萘酚作用下经水解、脱水、缩合等反应生成有色缩合物。.萘酚试剂的配置甲液:.萘酚,溶解于乙醇中。乙液:浓硫酸;使用时,分别加入等体积的两液。.糖以及甙类定性鉴别方法%乙醇水浴热提次,得提取液,旋转蒸发仪挥干乙醇,过滤后分称取生药粉末,用别加入浓硫酸和.萘酚。空白对照管将提取液换成蒸馏水,其它步骤相同。.醌类的鉴定.
16、原理醌类物质在碱性条件下加热能迅速被醛类还原,再与邻二硝基苯反应生成紫色化合物。.醌类定性鉴别方法%乙醇。水浴热提次,得提取液,旋转蒸发仪挥干乙醇,用%称取廷生药粉末,用液定容到,加热加入甲醛,再加入邻二硝基苯。空白对照管将提取液换成蒸馏水,其它步骤相同。.酚性化合物的鉴定.原理绝大多数酚类成分的水溶液或者醇溶液与三氯化铁试液反应,能产生蓝、绿、紫或红色。.酚性化合物定性鉴别方法%醇水浴热提次,得提取液,加入%氯化铁试液。空白对称取生药粉末,用照管将提取液换成蒸馏水,其它步骤相同。.结果与讨论生物碱大量存在于木姜子属植物中,具有抗菌、镇痛、抗肿瘤、强心以及降血压的作用【。在生物碱鉴定过程中,滴加过滤液的滤纸上出现红棕色斑点若干,而未滴加滤液的则无斑点出现,说明牛蒡皮中可能含有生物碱;黄酮类化合物广泛存在于蔬菜、水果、牧草和药用植物中,许多植物的叶、皮、根和果实中都含有一定量的黄酮类化合物,具有抗炎、免疫调节、抗衰老以及抗氧化等功划。在黄酮类化合物鉴定过程中,滴加过滤液的滤纸上
