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1、普飞生物商城普飞生物商城 试剂耗材一体化采购平台试剂耗材一体化采购平台简便、快捷、准确临床诊断中的 FISH 检测FISH（即荧光原位杂交）技术作为分子诊断的重要工具，在科研和临床诊断领域都有着广泛的应用。FISH 检测是利用荧光基团标记 DNA探针，再将标记的 DNA 探针与样本DNA 进行原位杂交，最后在荧光显微镜下对荧光信号进行计数，以此作为诊断的依据。FISH 的操作简便快捷，结果直观准确，因此 FISH成了许多疾病诊断的首选工具。下面我们将从探针的设计，样本的制备，原位杂交和检测结果的观察等几个方面简单介绍 FISH 的操作。探针是 FISH 检测灵敏度和准确性的关键。FISH 检
2、测的准确性来源于探针的设计。FISH 能否应用于某一领域也取决于是否具有相应的探针。用于 FISH 检测的探针必须具备很高的特异性，能特异性地识别特定的基因或染色体上特定的片断。而且 FISH 的探针必须能经受原位杂交的处理而不变性。荧光基团的标记也直接影响了检测的灵敏度和原位杂交结果的检测方式。以著名的探针生产商 Vysis 公司的LSI 系列探针为例：LSI 系列探针探针的预备探针的预备1. 让探针加热至室温，降低探针的粘度，使用合适的移液管 2. 振荡混合。用微型离心机将内容物离心（1-3 秒）至底部。轻轻振荡再次混匀 3. 注意：该探针已经经过变性可直接与样本片子反应。若探针是非降解型
3、，需进行735 分钟的变性 杂交杂交1. 在片子上，将 10L 的CEP18/X/Y 混合探针加到一个反应区，将 10 的LLSI13/21 混合探针加至另一个反应区。将 22mm22mm的盖玻片立刻覆盖反应区，使探针溶液弥漫整个覆盖区。气泡会干扰杂交，因此必须排除气泡注意：在盖玻片覆盖前，不普飞生物商城普飞生物商城 试剂耗材一体化采购平台试剂耗材一体化采购平台来源于 BAC 大片断基因组文库，探针所覆盖的染色体片断总长可达100Kb400Kb，保证了探针的高特异性和极强的荧光信号；荧光基团采用直接标记法标记，不同波长的荧光基团使探针在荧光显微镜下呈现多种荧光信号，借此我们可以一次检测多个染
4、色体或基因的异常；由于探针具有极强的荧光信号因而对 FISH 结果的检测也采用直接检测法，即在荧光显微镜下直接观察FISH 的信号，而无需抗原抗体反应对荧光信号进行放大。Vysis 探针的设计既确保了探针的特异性和灵敏度，同时直接的镜检也使 FISH检测更简便。FISH 检测对被测样本没有特殊的要求。可以是来自骨髓的细胞，也可以是来自羊水的细胞；可以是冰冻切片的样本，也可以是经过石蜡包埋的样本。甚至可以利用尿液样本进行膀胱癌复发的预后。获取的样本细胞也无需经过培养扩增，FISH 检测可以显示单个细胞核内染色体的异常情况。我们以 Vysis 公司的AneuVysion 多色 DNA 探针试剂盒为
5、例，简要介绍 FISH 的原位杂交过能在多目标区加探针溶液；盖玻片应 37预热 2. 用树胶封片：用 5ml 的注射器吸去树胶，在盖玻片的四周加上树胶 3. 将封好的片子放入 37预热的杂交盒中，盖紧盖子，37孵育 6-24 小时 杂交后的冲洗杂交后的冲洗1. 在科普林染色缸中加入0.4SSC/0.3%NP-40。将染色缸放入 731的水浴中半小时以上，使0.4SSC/0.3%NP-40 溶液的温度达到 731。每批使用前都必须确保0.4SSC/0.3%NP-40 溶液的温度达到 731 2. 在科普林染色缸中加入2SSC/0.1%NP-40，放置至室温。两种洗液使用过一天后就应丢弃 3. 挪
6、去树胶和盖玻片，将片子立即放入 731装有普飞生物商城普飞生物商城 试剂耗材一体化采购平台试剂耗材一体化采购平台程。AneuVysion 多色 DNA 探针试剂盒用于羊水细胞的产前诊断，样本是来源于羊水的细胞。试剂盒通过两组 5 种探针（LSI13/21 和CEP18/X/Y）同时检测 5 个染色体的数目异常，以此为依据进行产前诊断。样本的制备样本的制备1. 1000 转/分离心羊水（AF）5 分钟。羊水应没有血色或褐色。 2. 用 2-5ml 的 1胰酶/EDTA溶液（0.05%胰酶，0.53MEDTA4Na 的 Hank 氏平衡盐溶液，不含CaCl2、MgCl2.6H2O、MgSO4.7
7、H2O）悬浮沉淀，37水浴 15 分钟以上 3. 1000 转/分离心 5 分钟 4. 用 2-5ml 的 0.56%KCl 溶液悬浮细胞，37水浴 20 分钟。这些处理步骤的目的是使羊水细胞成为悬浮的单细胞。 5. 加 0.8-2ml 的固定液（31甲醇冰醋酸）至细胞低渗液中，轻轻混匀 0.4SSC/0.3%NP-40 的科普林染色缸中，漂洗 3 秒左右。其他片子同样操作，然后孵育 2 分钟。不要同时操作 4片以上。假如操作 4 片以上，取保 0.4SSC/0.3%NP-40的温度在 731注意：在洗浴前不能揭去盖玻片。当最后一片进入洗液后，开始计时 2 分钟 4. 将片子放入装有2SSC/
8、0.1%NP-40 的科普林染色缸中室温放置 5-60 秒，漂洗 1-3 秒 5. 在暗处风干（一个关上的抽屉或是柜子就可以满足要求）6. 加入 10LDAPI复染，盖上盖玻片。暗处避光保存 储存储存在暗处-20保存杂交玻片。玻片在上述的条件下可以保存超过12 个月而不影响荧光信号的强度。为了长期保存还可以用盖玻片密封防止干燥。片子存放于-20下普飞生物商城普飞生物商城 试剂耗材一体化采购平台试剂耗材一体化采购平台6. 1000 转/分离心悬液 5分钟，用 1ml新的固定液重新悬浮细胞。4保存固定的样本 30 分钟以上，直至 FISH 检测前。若要长期保存，-20保存在固定液中 7. 制片前
9、根据悬浮细胞数调整悬液的体积。若储存时间超过一个月以上，在制片前用固定液清洗细胞 8. 直接滴加细胞悬液至 1-2 片预冷的玻片上，每片 2 个杂交区(每个区域 15-25L 细胞悬液) 样本的老化样本的老化（目的是为了使 FISH达到最佳效果）1. 将样本片子放入 2SSC371 小时 2. 将片子放入新制的胃蛋白酶工作液中（20L10%胃蛋白酶溶液中加入40ml0.01NHCl）3713 分钟 FISHFISH 结果的观结果的观察察在荧光显微镜下观察时，应先对片子的适用性进行评估。评估的标准如下：探针信号的强度：信号应该明亮、清晰和容易分辨。信号是明亮紧凑的卵圆形或纤维状，弥散的卵圆形 背
10、景：背景应该是黑色，没有粒状或是朦胧的荧光 交叉杂交/目标特异性：探针应该特异性地只和目标DNA 结合。 假如出现上述任何一种达不到标准，应重新进行杂交。选择最好的视野区，计数细胞核选择最好的视野区，计数细胞核用 25 倍物镜观察杂交区样本的分布。选择样本分布稀疏的区域，在此区域内没有间期核或中期扩展的重叠，可以观察到部分的间期核。避免选择细胞密集、重叠或核的边界模糊无法辨认的视野。避免视野下出现成团的细胞。只计数信号不普飞生物商城普飞生物商城 试剂耗材一体化采购平台试剂耗材一体化采购平台3. 用磷酸盐平衡液（PBS）室温下清洗 5 分钟 4. 将片子放入快速固定液（0.95%甲醛：1ml
11、的 37%甲醛，0.18gMgCl2 和 39ml 的PBS，4保存，一个月内使用）室温 5 分钟 5. 在室温下用 PBS 清洗 5 分钟 6. 晾干片子。为了加速晾干可以用带棉塞的巴氏移液管吹打玻片 7. 将片子浸泡在 70%的乙醇中。用乙醇冲洗 1 分钟 8. 从 70%乙醇中取出，依次放入 85%、100%乙醇中重复以上步骤 9. 根据需要降解片子 样本样本 DNADNA 的变性的变性1. 片子的制作前将湿润的杂交盒（盒的边缘用 13 英寸的杂交膜或杂交纸密封）放入 37孵箱内预热至 37 连续的细胞计数扫描计数扫描：用 40 倍或 63 倍的物镜，从选择区域的左上开始计数，从左往右，
12、计数中期扩展和间期核边缘的信号数。依据荧光信号的计数结果，结合染色体计数标准作出正确的诊断。注意：以上介绍的步骤由 Gene 公司提供，仅供参考，具体的操作以产品说明书为准为了进一步简化操作，Vysis公司还推出 FISH 杂交仪和自动预处理系统，配合 AI 公司的染色体扫描计数系统，更能使 FISH 检测和分析实现自动化，大大节省了研究者的时间和精力。FISH 检测的操作简便，但是这并不意味着随便。相反，FISH 对检测的条件要求很高。检测过程中的温度、试剂的酸碱度，反应的时间都会对结果产生影响。因此在操作中应注意：杂交前样本的老化相当重要，尤其是胃蛋白酶的浓度、消化的时间掌握不好，直接影普
13、飞生物商城普飞生物商城 试剂耗材一体化采购平台试剂耗材一体化采购平台2. 在科普林氏染色缸中加入变性溶液，731水浴 30 分钟以上。使用前测量温度。 3. 每次使用前测定变性溶液的PH 值，确保在 7.0-8.0 之间。将样本片子浸泡入 731变性溶液中 5 分钟降解样本的 DNA。每个染色缸中的片子不能超过 4 张。 4. 用镊子拿出片子立刻放入室温的 70%乙醇洗液中，漂洗片子除去甲酰胺。片子放入乙醇溶液中一分钟 5. 从 70%的乙醇中拿出片子，依次放入 85%、100%乙醇中重复上述步骤 6. 用吸水纸从玻片的底部吸去多余的乙醇，并抹干片子的外缘 7. 在加入探针溶液前将片子加热至
14、 45-502 分钟（不得超过）注意：假如在探针准备杂交前，片子的闲置会超过 2 分钟，请将片子放入盛有 100%乙醇的染色缸中保存。在预热前不要让片子干燥 响杂交的效果。若消化过度，细胞出现“鬼影”或整个组织消失成为废片；若消化不足，则显示持续的自发荧光或者差的 DAPI 染色 操作过程中的温度控制应严格按照产品说明书，而且在反应前把液体预温到所要求的温度，检测中所使用的设备例如盖玻片、载玻片都应注意预热 各步骤时间应准确，每次操作都要迅速 为防止淬灭，杂交后的洗脱和晾干要注意避光。可以加入抗淬灭剂 此种片在-20避光保存 1周。若要长期保存，应加入抗淬灭剂 只有细心的操作，FISH 才能真正成为准确而简便的诊断工具。注：上述设计的产品试剂和相关资料由Vysis 提供，基因公司独家代理
