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1、中华结 核和呼吸杂 志 2 0 1 1年 1 O月第 3 4卷第 1 O期C h i n J T u b e r c R e s p i r D i s ，O c t o b e r 2 0 1 1 ，V o 1 3 4 ，N o 1 0 罗格列酮对慢性 阻塞性肺疾病患者 过氧化物酶体增殖物激活受体一 信号通路 的影响 曾晓丽 刘晓菊 包海荣 张艺 谭恩丽 廖剑敏 【 摘要】 目的探讨罗格列酮对 C O P D患者过氧化物酶体增殖物激活受体一 ( P P A R 一 ) 、 核因 子一 K B及肿瘤坏死因子一 ( T N F 一 仅) 的影响。方法2 0 1 0年 4 1 1月 ， 选择 C
2、O P D急性加重期患者 3 0例， 其中男 2 2例， 女 8例 ， 年龄 5 48 7岁， 平均( 7 2 9 ) 岁； 健康体检者 ( 对照组) 2 4例 ， 其中男 1 8 例， 女 6例 ， 年龄5 2 8 O岁， 平均( 6 91 0 ) 岁。抽取受试者空腹肘静脉血 1 0 m 1 ， 分离培养外周血单个 核细胞( P B MC s ) 。将 3 0例 C O P D患者的 P B MC s 均分为 3份， 分别根据不同的药物干预分为非干预 组、 罗格列酮干预组 ( 罗格列酮组) 和罗格列酮联合 G W9 6 6 2干预组( 联合干预组) ， 对照组 P B MC s 不 加任何药
3、物干预。采用实时荧光定量 P C R检测 P B MC s中P P A R 一 - , 和核因子一 K B的mR N A表达， 细胞 免疫荧光法结合激光扫描共聚焦显微镜检测 P P A R 一 和核因子一 K B蛋白表达及核转位， 酶联免疫吸附 试验检测细胞培养上清液中T N F - 0 l 含量。多组间比较采用方差分析， 组间两两比较采用 L S D t 检验， 相关性分析采用 P e a r s o n检验。结果 m R N A( 2 c t 值) 和蛋 白表达 ( 荧光强度值) ： 非干预组 P P A R 一 ( 0 5 2 0 1 0和5 51 1 ) 低于对照组( 1和 8 5 9
4、 ) ， 核因子一 K B ( 1 6 9 0 0 7和 1 4 51 7 ) 高于 对照组 ( 1 和 1 1 87 ) ； 罗 格 列 酮 组 P P A R 一 ( 4 4 70 1 1和 2 0 41 2 ) 高 于 非 干 预 组 ， 核 因 子一 K B ( 0 3 3 0 0 4和5 91 4 ) 低于非干预组； 联合干预组 P P A R 一 - y ( 2 2 50 3 1和 1 4 2 2 3 ) 低于罗格列酮 组， 高于非干预组， 核因子一 K B( 0 6 4 0 0 2和9 01 0 ) 高于罗格列酮组 ， 低于非干预组； 组间比较差异 均有统计学意义 ( F值 为
5、2 9 2 1 5 6 7 4 2 ， 均 P0 0 5 ) 。本研究获得医院伦理委员会批准 ， 所有 研究对象均签署知情 同意书。 二 、 研究方法 1 主 要 试 剂 与 仪 器 ： 罗 格 列 酮 纯 品 ( 美 国 A m r e s c o 公司) ， G W9 6 6 2 ( 美国 S i g ma 公司) ， R N A提 取试 剂 盒 及 实 时 荧 光 定 量 P C R 试 剂 盒 (日本 T a K a R a公 司 ， 批 号 ： B K 2 5 0 4 、 B K 2 4 0 1 、 B K 2 8 0 2) ， P P A R 一 核因子 K B和 内参照 p 肌动
6、蛋 白引物 ( 大 连宝生物工程有限公 司) ， 兔抗 P P A R 一 y 、 核 因子- K B p 6 5多克隆抗体及异硫氰酸荧光素标记 I g G( 武汉博 士德生 物 工 程公 司) ， T N F 一 仅酶 联 免 疫 吸 附试 验 ( E L I S A) 检测试剂盒 ( 美 国 R D B i o s c i e n c e s 公 司， 批 号 ： D Z E 7 5 2 4 9 3 1 ) ， 酶 标 分 析 仪 ( 美 国 B i o T e k公 司) ， R O T O R G E N E 3 0 0 0型定量 P C R仪 ( 澳 大利亚 C o t b e t
7、t 公 司) ， T C S S P 2型激光 扫描共 聚焦显微镜 ( 德 国 L e i c a 公司) 。 2 P B MC s 分离与培养 ： 无菌抽取受试者空腹肘 静脉血 1 0 ml ， 肝素抗凝 ， 淋巴细胞分离液梯度分离 P B MC s ， 用含 1 0 胎牛血清 的 1 6 4 0培养液重悬 细 胞 ， 调整细胞密度至 21 0 。 L ， 接种于 2 4孔细胞培 养板 ， 每孔 1 5 ml 。对照组 P B MC s 不加任何药物干 预 ， 加入含 1 0 胎牛血清 ， 1 0 0 k U L青霉素 、 链霉素 双抗 ， 3 谷氨酰胺 ， 1 0 0 k U L的 白细胞
8、介 素( I L ) 2 的 1 6 4 0培养 基 常规 培养 ； 将 3 0例 C O P D患 者 的 P B MC s 均分为 3份 ， 分别根据不同的药物干预分 为 非干预组 、 罗格列酮干预组 ( 罗格列酮组) 和罗格列 酮联合 G W9 6 6 2干预组 ( 联合干预组 ) ， 非干预组同 对照组 ， 罗格列酮组在非 干预组基础上加入终浓度 为 1 0 p m o l L的罗格列酮 ， 联合 干预组 在非 干预组 基础上加入终浓度 为 1 p m o l L的 G W9 6 6 2预处理 1 h A ， 再加入终浓度为 1 0 m o l L的罗格列酮 。细 胞于 5 C O 、
9、 3 7下培养 4 8 h后 ， 取 1 0 0 I x l 细胞悬 液甩片， 用于细胞免疫荧光检测， 其余细胞收集于 E P管 中， 一 2 0保存 ， 用于提取 R N A； 细胞上清液 一7 0冻存备用。 3 实时荧 光定量 P C R检测 ： 收集 P B MC s 提取 总 R N A，实 时 荧 光 定 量 P C R 检 测 P P A R 和 核因子一 K B 的 mR N A表达水平 ， 操作步骤按 照试 剂 盒说 明 书 进 行。P P A R -y上 游 引 物 ： 5 T G G A A T T A G A T G A C AG C G A C T Y G G - 3
10、， 下 游 引 物 ： 5 一 C T G G A G C A G C ， 丌G G C A A A C A 一 3 ， 扩增长度为 1 8 2 b p ； 核 因子一 K B上 游 引 物 ： 5 一 G A C G C A T Y G C T G T G C C T r C 一 3 ， 下游 弓 I 物 ： 5 一 T T G A T C G T G C T C A G G G A T G A C 3 。 扩增 长 度 为 9 1 b p ；3 - 肌 动 蛋 白 上 游 引 物 ： 5 一 T G G C A C C C A G C A C A A T G A A - 3 ， 下 游 引
11、物 ： 5 ， _ C T A A G T C A T A G T C C G C C T A G A A C C A 一 3 ，扩 增 长 度 为 1 8 6 b p 。 扩增条件 ： 9 5 预变性 3 0 S ， 9 5变性 5 S ， 6 0退火 3 0 S ， 7 2 o ( 二 延伸 3 0 S ， 最后 7 2 o C延伸 1 m i n ， 5 5 延 伸 3 0 S ， 共 4 5个 循 环 ， 反应 体 系 为 2 5 l 。 利用检测到的荧光信号 ， 每份标本 分别 得到 扩增 曲线和熔点 曲线 ， 检测反应的特异度并得 出各 自的循环阈值 ( c t 值 ) 。基 因表
12、达分析采用 2| C t 法 ， 通过计算 2 - A A C t 值 可得到各样本 R N A的相对 含量 ， A A C t =( C t目的基 因 一C t内参基 因 ) 干 预 钼一 ( C t 目的基 因 一C t 内参基因) 对 醐 。 4 细胞免疫荧光法检测 ： 取培养 4 8 h的 P B MC s 1 0 0 l 甩 片 ， 用 4 多 聚 甲醛室 温 固定 3 0 m i n ， 用 0 2 T r i t o n X 1 0 0室温下作用 2 0 m i n ， 加入 1 牛 血清白蛋白 3 7 c I = 封闭 3 0 m i n ， 滴加兔抗 P P A R 和 核因
13、子 s ： B p 6 5多克隆抗体 ( 稀释度 1 ： 5 0 ) ， 置湿盒 内4过夜， 滴加羊抗异硫氰酸荧光素标记的二抗 ( 稀释度 1 ： 5 0 ) ， 3 7避光孵育 1 h ， 缓 冲甘油封片 ， 激光扫描 共 聚焦显微 镜下 观察 并采 集 图片 ， 采 用 L e i e a C o n f o c a l 图像分 析 软件 进行 荧光 强度 分 析。 每张玻片选 取细胞 分布 均匀 的 5个视 野 ， 各视 野 选取 5个细胞 ， 测量细胞 内荧光强度 ， 以 5个细胞 的 荧光强度 平均 值作 为该视 野 的测量 值 ， 最后计 算 5个视野测量值 的平均值作 为该受试者
14、 P B MC s中 目的蛋 白的荧 光强 度。荧 光强 度越低 ， 激 活状 态 越弱。 5 细胞上清 液 中 T N F 仅测定 ： 取培养 4 8 h的 P B MC s 离心 ， 取上清液 于 一7 0冻存 ， 用 E L I S A试 剂盒测定 T N F 一 仅含量 ， 操作步骤按照试剂盒说 明书 进行 。 三、 统计学处理 采用 S P S S 1 3 0统计软件进行统计学分 析 ， 多 组间比较采用方差分析 ， 组间两两 比较采用 L S D t 检验 ， 相关性分析采用 P e a r s o n检验 ， 以 P 0 0 5为 差异有统计学意义。 结 果 非干预组 P P A
15、 R一 y 的 m R N A和蛋 白表达均低 于 对照组 ， 核因子一 K B的 m R N A和蛋 白表 达均高 于对 照 组 ， T N F 一 浓度 也高于对 照组 ( 表1 ) 。 罗格列酮 中华结核 和呼吸杂志 2 0 1 1年 1 O月第 3 4卷第 l 0期C h i n J T u b e r c R e s p i r D i s ，O c t o b e r 2 0 1 1 ，V o 1 3 4， N o 1 0 与视黄素 x受体形成异源二聚体 ， 并与辅阻遏 因子 结合成复合物 ， 使 P P A R 一 处于失活状态 。当配体 与 P P A R 一 结合后 ， P P A R 视黄素 x受体 二聚体 空间构象发生改变 ， 与辅阻遏因子脱离 、 去抑制 ， 并 募集辅激活因子 ， 进入核内与过氧化物酶反应元件 结合 ， 激活靶基 因的转 录。P P A R 活化后可 以抑 制 中性粒细胞浸润， 减少炎症因子的表达 ， 减轻肺组 织 的炎性损伤 J 。P P A R 的激 活还能抑制吸烟者 单核 细胞源性巨噬细胞 T N F 一 的分泌_ l 。本研究 结果 显 示， P P A R 一 在 健 康 人 和 C
