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1、中国疾病预防控制中心病毒病拎制所博 卜 学位论文缩略词表缩略词对照表Abbr e v i a t i o n英文缩写英文名称中文名称P r PP r i o n p r o t e i n阮蛋白D o p p e l p r o t e i nT r a n s m i s s i b l e s p o n g i f o r m e n c e p h a l o p a t h i e sCr e u t z f e l d t - J a c o b d i s e a s e sG e r s t m a n n - S t r a u s s l e r - S c h e i n
2、 k e r s y n d r o m ef a t a l f a m i l i a l i n s o m n i aD o p p e l蚤白可传播性海绵状脑病克一雅氏病G S S 综合症家族性致死性失眠症Di t h i o t h r e i t o lP o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o re s i sP h o s p h a t e b u ff e r e d s a l i n eP o w e r o f h y d r o g e nP o l y m e r a s e c h a i n r
3、 e a c t i o nP h e n y l - m e t h y l s u l f o n y l fl u o r i d ePr o t e i n a s e K二硫苏糖醇聚丙烯酞胺凝胶电泳磷酸盐缓冲液划?sE?JDiss7FI爪AGBsHDTCGFDRPIPIP CRS DSH o r s e r a d i s h p e r o x i 山 ” .3 - ( 4 , 5 ) - d i m e t h y l t h i a h i a z o ( - z - y l ) - 3 , 5 - d i - P h e n y t e t r a z o l i u m r
4、 o m i d eD u l b i c o s Mo d i f i e d E a g l e Me d i u mMo l e c u l a r w e i g h tP o l y v i n y l i d e n eR o t a t i o n p e r m i n i u t eS o d i u m d o d e c y l s u l f a t eN ,N ,N ,N - t e t r a m e t h y l e t h y l e t h y l e n e - d i a m i n e酸碱度聚合酶链式反应苯甲基磺酞氟蛋白酶 K辣根过氧化物酶澳化 3一(
5、 4 , 5 一二甲 基 唾哇2 一) 一2 . 5 一 二苯基 四氮哇 细胞培养基分子量聚二氟乙烯每分钟转数十二烷基硫酸钠四 氨基乙二胺FM， PMPKHRMT叫川叫rPm中国疾病预防控制中心病毒病控制所博士学位论文缩略词表T r i sECLT r i h y d r o x y m e t h y l a m i n o m e t h a n eE n h a n c e d c h e r n i l u r n i n e s c e n c e三羚甲基氨基甲烷增强化学发光O p t i c a l d e n s i t yGl u t a t h i o n e - S - T
6、 r a n s f e r a s eB a s e p a i rD e o x y r i b o n u c l e i c a c i d光密度谷肤甘肤硫转移酶碱基对D e o x y n u c l e o t i d e t r i p h o s p h a t ek i l o d a l t o nL u r i a B r o t hBo v i n e s e n mt a l b u mi nWe s t e rn b l o t脱氧核搪核昔酸脱氧三磷酸核昔酸千道尔顿细菌培养基牛血清白蛋白免疫印迹)T认TTaA.onGsbPDN献kDILBBslwn学位论文原创性、真
7、实性声明本人郑重声明: 人D o p p e I 蛋白生物学功能的初步研究)是本人在中国疾病预防控制中心 ( 免疫学)专业攻读 领 冷 位 期 间 ， 在 导 师 指 导 下 完 成 的 硕 士 学 位 论 文 我 承 诺: 本论文中所涉及的所有数据、试验记录以及研究结果均真实可信，引用资料已注明出处，无A ll 窃、篡改、抄袭之行为。如本论文原创性方面出 现问题，我愿负 法律责任。本课题的研究成果归中国疾病预防控制中心所有， 发表文章的单位署名为中国疾病预防控制中心。特此声明!学位论文作者 ( 签名):研究生导师 ( 签名) :落户 扮2 0 0 7 年月日2 0 0 7 年月日矛湃 苏了中
8、国疾病预防控制中心病毒病控制所博上 学位论文中文摘要人D o p p e l 蛋白 生物学功能的 初步研究博士 研究生:导师:指 导 教 师专业:李萍蓝小平 教授韩俊 副教授免疫学( 中国疾病预防控制中心 病毒病预防控制所 阮病毒病室)( 传染病预防控制国家重点实验室)摘要阮病毒病 ( P r i o n d i s e a s e ) ，又称可传播性海绵状脑病 ( T r a n s mi s s i b l es p o n g i f o r m e n c e p h a l o p a t h i e s , T S E ) ， 是一 类累及多 种动物和人类中 枢神经系 统的致死性退
9、行性疾病， 潜伏期长， 病死率1 0 0 %， 包括人的克雅氏病、 吉斯综合症、家族性致死性失眠症和库鲁病，动物的羊痰痒病、疯牛病等。目前的研究认为，T S E 感染因子是一种空间 构象改变的异常蛋白( P r p s ) ，由 存在于神经元细胞的正常阮蛋白( P r P c ) 转 化而 来， 然而对P r p , 的 确切功能及T S E的 准 确致病机制尚不确定。人P R N 。 基因 编 码的D o p p e l ( D p l ) 蛋白 是 新 近发 现的P r p 相 关蛋白 ， 与P r P c具有相似的结构及生物化学特征， 从而为肮病毒研究开辟了一个新的途径。 我们根据G e
10、 n B a n k 公布的人P R N D c D N A序列设计合成特异性引物，用P C R方法从人外周血白 细胞总D N A中 扩增获得5 3 1 b y 的 人P R N D完整基因 序列， 测序正确后克隆至 表达载体， 转化大肠杆菌J M 1 0 9 , I P T G诱导 表达重组人D p l ( r h D p l )蛋白。目 的蛋白以 包涵体形式表达， 表达量占菌体总蛋白的6 0 %以上。 表达产物中国疾病预防控制中心病毒病控制所博士学位论文中文摘要用N 产 十 亲和层析柱纯化及经胺化学裂解法去除标签蛋白，S D S - 以G E 检测证实，纯化的r h D p l 蛋白 相
11、对分子量约为1 5 M T r y p a n B l u 。 及M T T 实 验显示， 在5 0ji g / - L及以 上剂量 时， r h D p l 蛋白 具有抑制人神经母细胞瘤S H - S Y 5 Y细胞 生长的作用， 在1 0 0 l tg h n L 及以 上剂量时， r h D p l 具有杀伤H e L a 细胞的 活性， 呈 现明显的剂量和时间 依 赖性。 这些结果 提示D p l 蛋白 具有体 外细胞毒 作用， 并呈现明显的组织类型特异性。为了 解D p l 蛋白 细胞毒 性决定 簇， 我们对D p l 基因 进行了 分段原核表达， 主要针对D p l 蛋白 上的 三
12、个a 螺旋 及两个p 折叠对其进行划分。 用纯化后的各种分段表达蛋白 进行体外细胞毒性分析表明，其细胞毒性决定簇位于蛋白C端氨基酸8 1 - 1 2 2 位，且与N端无规卷曲 结构无关。为 研究正常阮蛋白( p r p ) 对D p l 蛋白 细胞毒活性的影响，我们通过p r p蛋白与D p l 蛋白共处理人神经母细胞瘤S H - S Y 5 Y细胞后观察细胞的生长状况，并检测了二价铜离子对两者相互作用的影响， 结果证明正常阮蛋白即全长野生型重组人P r p 蛋白可明显 拮抗D p l 蛋白引 起的神经细胞毒活性， 呈现明显的剂量和时间依赖性，有神经保护活性。且二价铜离子增强了P r p的神经
13、保护作用。为了 解P r P 蛋白 上何种结 构域对D p l 蛋白 细胞毒活 性起了 拮抗作用， 我们构建了多个截断及八肚插入突变体，包括 N端小片段、N端大片段、C端片段，以 及含有插入了4 个额外及7 个额外八肤重复序列全长P r p 蛋白， 在大肠杆菌中表达这些突变体蛋白。 细胞毒活性分析后发现， 野生型P r p 对培养细胞的生长有一定促进作用，而P r p蛋白N端大片段氨基酸3 2 - 1 2 1 位缺失，4 个及7 个八肤重复序列额外插入后具 有神经细胞毒活性。 进一步将各 突变体蛋白 与D p l 共处理人神经母细胞瘤S H - S Y 5 Y细胞后观察细胞的生长状况，发现P
14、r p 蛋白 上D P I 蛋白神经细胞毒性的拮抗部位位于P r p蛋白N端氨基酸的第2 3 - 9 0 位。 以上实验说明P r p 蛋白N端无规卷曲结构具有神经保护作用。为了 进一步分析D p l 对人S H - S Y 5 Y细胞的 作用及机制， 我们将重组人D p l蛋白 作用S H - S Y 5 Y细胞， H o e c h s t 3 3 3 4 2 染色可见细胞核染色质浓集， 呈致密的强荧光， 呈现出明显剂量依赖关系。D N A末端原位标记染色法 ( T U N E L )发现出现多量的阳性着色细胞。 A n n e x i n V / P I 双染实验均检测显示凋亡细胞数量明
15、显增加。 这些结果提示D p l 蛋白 对S H - S Y 5 Y细胞毒性作用可能是通过细胞凋亡机中国疾病顶防控制中心病毒病控制所博士学位论文中文摘要制。进一步观测D p i 蛋白 细胞毒作用过程中 细胞内活性氧的变化，我们将C u / Z n超氧化物歧化酶 和一 氧化氮合成酶( N O S ) 抑制剂L - N A M E 分布同 时与D p l 蛋白 导入S H - S Y 5 Y细胞， 观 测对细胞生 长的 影响。 结果发 现U N A M E 可明显 抑制D p l蛋白引 起的神经细胞毒性，而加入 C u / Z n超氧 化物歧化酶对 D p l 蛋白 诱导的S H - S Y 5
16、Y细胞毒 性作用无明 显影响。同时 我们还 通过W e s t e rn b l o t i n g检测发现D p l 蛋白 刺激人神经母细胞瘤 S H - S Y 5 Y细胞过程中 N O S及血红素氧化酶 1( H O - 1 ) 的 表达水平 升高。 这提示D p l 蛋白 引 起的 神经细胞毒性可能 是通过N O S及 H O - 1 途径介导的。随后， 我们构建了 人P R N D基因及P R N P N端缺失 ( X3 2 - 1 2 1 ) 突变基因真核表达质粒， 转染S H - S Y 5 Y细胞4 8 h 后可 检测到D p l 及P r P 43 2 - 1 2 1 的 表达.通过M T T 方法检测细胞活力; 采用丫 睫橙/ 漠化乙锭( A O / E B ) 染色及D N A L a d d e r分析神经母细胞瘤细胞凋亡; 罗丹明1 2 3 和D C F A染色测定线粒体跨膜电位和活性氧水 平变化; 底物染 色反应检测c a s p a s e - 3 活性; W e s t e rn - b l o t 分 析线粒体相关蛋
