可溶性糖的测定

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1、实验 1 可溶性糖的测定一、实验目的 1学习蒽酮比色定糖法的原理和方法。 2学习 721 型分光光度计的原理和操作方法。二、实验原理 总糖是指样品中的还原单糖及在本法测定条件下能水解成还原单糖的蔗糖、麦芽糖和 可部分水解为葡萄糖的淀粉。 蒽酮比色法是测定样品中总糖量的一个灵敏、快速、简便的方法。 其原理是糖类在较高温度下被硫酸作用脱水生成糠醛或糖醛衍生物后与蒽酮 （C14H10O）缩合成蓝色化合物。溶液含糖量在 150g /ml 以内，与蒽酮反应生成的颜色深 浅与糖量成正比。 蒽酮不仅能与单糖也能与双糖、糊精、淀粉等直接作用，样品不必经过水解。三、实验器材 1试管（或具塞试管） 2. 吸量管及

2、试管架（1 ml、10 ml） 3沸水浴 4. 冰浴 5721 型分光光度计 6蒽酮试剂 称取 100 mg 蒽酮溶于 100 ml 98%硫酸溶液（A.R）中，用时配制。 7葡萄糖标准溶液（100 g/ml）200 ml 精确称取 100 mg 干燥葡萄糖，用蒸馏水定容至 1000 ml。 8样品溶液 200 ml 可自选待测物制成样品溶液。 举例：称取 500 g 市售白薯（或淀粉） ，洗净切碎后用多功能食品加工机磨成浆，4 层 纱布压滤、弃滤液溜渣，将渣放于烘箱内 8085烘干后，再用植物粉碎机（微型）研细， 过筛，取 100 目筛下物为待测样品。 取样品在烘箱内 105烘干，恒重后，精

3、确称取 15 g，置于锥形瓶中，加入 80 ml 沸蒸馏水，放入沸水浴。不时摇动，提取 0.5 h。取出立即过滤，残渣用沸蒸馏水反复洗涤 并过滤，合并滤液。冷却至室温，用蒸馏水定容至 100 ml。 9白薯。四、实验步骤： 1制作标准曲线 取 7 支干燥洁净的试管，编号后按下表操作。编号 试剂(ml)1234567葡萄糖标准液（100g/ml） H2O 蒽酮试剂0 1.0 100.1 0.9 100.2 0.8 100.3 0.7 100.4 0.6 100.6 0.4 100.8 0.2 10每管加入葡萄糖标准液和水后立即混匀，迅速置于冰浴中，待各管都加入蒽酮试剂1后，同时置于沸水浴中，准确

4、加热 7 min，立即取出置冰浴中迅速冷却。待各管溶液达室温后， 用 1 cm 厚度的比色皿，以第一管为空白，迅速测其余各管的光吸收值。然后以第 27 管1 要在冰浴条件下加入蒽酮，以防止发热，影响颜色反应。生成的颜色较稳定，在 4 h 内无明显变化。溶液含糖量 g 为横坐标，吸光度（OD620）为纵坐标，画出含糖量与 OD620值的相关标准 曲线。 2测定样品的含糖量 取 4 支试管按下表操作。编号 试剂（ml）1234样品溶液 H2O 蒽酮试剂0 1.0 10.01.0 0 10.01.0 0 10.01.0 0 10.0其他操作与制作标准曲线相同。将第 24 管测出的 OD620平均值，

5、根据 OD620平均值 从标准曲线上查出相应的含糖 g 数，再换算成 100 g 样品中总糖的含量。五、思考题： 用蒽酮比色法测定样品中糖含量时，应注意什么？为什么？实验 2 氨基酸的总量测定和纸层析分离鉴定 甲醛滴定法测定氨基氮一、实验目的 初步掌握甲醛滴定法测定氨基酸含量的原理和操作要点。二、实验原理 氨基酸是两性电解质，在水溶液中有如下平衡：R CHNH3+COO-R CHNH3+COO-NH2+H+,是弱酸，完全解离时 pH 为 1112 或更高，若用碱滴定NH3+所释放的 H+来测量氨基酸， 一般指示剂变色减小于 10，很难准确指示终点。 常温下，甲配合能迅速与氨基酸的氨基结合，生成

6、羟甲基化合物，使上述平衡右移， 促使NH3+释放 H+，使溶液的酸度增加，滴定终点移至酚酞的变色域内（pH9.0 左右） 。 因此，可用酚酞作指示剂，用标准氢氧化钠溶液滴定。R CHNH3+COO-R CHCOO-NH2+H+NaOHHCHOR CHCOO-NHCH2OHR CHCOO- N(CH2OH)2如样品为一种已知的氨基酸，从甲醛滴定的结果可算出氨基氮的含量2。如样品是多种氨基酸的混合物，如蛋白水解液，则滴定结果不能作为氨基酸的定量依据。但此法简便 快速，常用来测定蛋白质的水解程度。随水解程度的增加滴定值也增加，滴定值不再增加 时，表示水解作用已完全。 三、实验器材 25 ml 锥形瓶

7、，3 ml 微量滴定管，吸管。 0.1 mol/L 标准甘氨酸溶液：准确称取 750.7 mg 甘氨酸，溶解后定容至 100 ml。 0.1 mol/L 标准氢氧化钠溶液32 脯氨酸与甲醛作用生成不稳定的化合物，使滴定 ml 数偏低。酪氨酸的滴定 ml 数偏高。3 标准氢氧化钠溶液应在使用前标定，并在密闭瓶中保存。不可使用隔日贮在微量滴定管中的剩余氢氧化钠。酚酞指示剂：0.5%酚酞的 50%乙醇溶液 中性甲醛溶液：在 50 ml 3637%分析纯甲醛溶液中加入 1 ml 0.1%酚酞乙醇水溶液， 用 0.1 mol/L 的氢氧化钠溶液滴定到微红，贮于密闭的玻璃瓶中。此试剂在临用前配制。如 已放

8、置一段时间，则使用前需重新中和。四、实验步骤 1取 3 个 25 ml 的锥形瓶，编号。向第 1、2 号瓶内各加入 2 ml 0.1 mol/L 的标准甘氨 酸溶液和 5 ml 水，混匀。向 3 号瓶内加入 7 ml 水。然后向 3 个瓶中各加入 5 滴酚酞指示 剂，混匀后各加 2 ml 甲醛溶液，再混匀。分别用 0.1 mol/L 标准氢氧化钠溶液滴定至溶液 显微红色。 重复以上实验 2 次，记录每次每瓶消耗标准氢氧化钠溶液的 ml 数。取平均值，计算 甘氨酸基氮的回收率。甘氨酸氨基氮回收率%=100加入理论量实际测得量公式中实际测得量为滴定第 1 和 2 号瓶耗用的标准氢氧化钠溶液 ml

9、数的平均值与 3 号瓶耗用的标准氢氧化钠溶液 ml 数之差乘以标准氢氧化钠的摩尔浓度，再乘以 14.008。 2 ml 乘以标准甘氨酸的摩尔浓度再乘 14.088。即为加入理论量的 mg 数。 2取未知浓度的甘氨酸深液 2 ml，依上述方法进行测定，平行做几份，取平均值。 计算每 ml 甘氨酸溶液中含有氨基氮的 mg 数。氨基氮（mg/ml）=式中：未为滴定待对测液耗用标准 NaOH 溶液的平均 ml 数。对为滴定对照液（3 号 V V瓶）耗用标准 NaOH 溶液的平均 ml 数。mol/LNaOH为标准 NaOH 溶液的真实摩尔浓度。 五、思考题 选用酚酞指示剂，为什么滴定的是氨基？ 氨基酸

10、的纸层析法分离鉴定一、实验目的 通过氨基酸的分离，学习纸层析法的实验原理及操作方法。二、实验原理 纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。 层析溶剂由有机溶剂和水组成。 物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用 Rf值（比移）来表示的：Rf=原点到溶剂前沿的距离离原点到层析点中心的距在一定的条件下某种物质 Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、 层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。三、实验器材 1层析缸42.毛细管 3喷雾器4.培养皿 5试析滤纸（新华一号） 6、试剂： （1）扩展剂：4 份水饱和的正丁醇和 1 份醋酸的混合 物。将 20 ml

11、正丁醇和 5ml 冰醋酸放入分液漏斗中，与 15 ml 水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层，加入 0.1%的茚三酮。取漏斗内的扩展剂约 5 ml 置于小烧杯中做 平衡溶剂，其余的倒入培养皿中备用。 （2）氨基酸溶液：赖氨酸、脯氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸溶液及它们的混合液 （各组份浓度均为 0.5%）各 5 ml。四、实验步骤： 1将盛有平衡溶剂的小烧杯置于密闭的层析缸中。 2取层析滤纸（长 22 cm、宽 14 cm）一张。在纸的一端距边 缘 23 cm 处用铅笔划一条直线，在此直线上每间隔 2 cm 作一记号 如右图。 3点样 用毛细管将各氨基酸样品分别点在这 6 个位置上，干

12、后再点一次。每点在纸上扩散的直径最大不超过 3 mm。 4扩展 用线将滤纸缝成筒状，纸的两边不能接触。将盛有约 20 ml 扩展剂的培养皿迅速置于密闭的层析缸中，并将滤纸直立于培养皿中（点样的一端 在下，扩展剂的液面需低于点样线 1 cm） 。待溶剂上升 1520 cm 时即取出滤纸，用铅笔 描出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。 5显色 将滤纸取出，置烘箱中烘烤 5 min（100）或用热风吹干即可显出各层析 斑点。 6计算各种氨基酸的 Rf值。五、思考题： 1何谓纸层析法？ 2何谓 Rf值？影响 Rf值的主要因素是什么？ 3怎样制备扩展剂？ 4层析缸中平衡溶剂的作用是什么？4 本实

13、验所用层析缸是用大的标本缸代替的。若用标准的层析缸，滤纸平衡后应用长颈漏斗从层析缸上部小孔中加入扩展剂。H2So4冷却弃残渣留滤液弃上清液留 RNA 沉淀实验 3 核糖核酸的分离、组分鉴定与定量分析一、实验目的 学习从酵母中分离 RNA 和鉴定 RNA 组分的方法，并用苔黑酚法测定 RNA 的含量。二、实验原理 RNA 和 DNA 分别存在于细胞质和细胞核中，分离提出核酸，首先要将细胞破碎制成 匀浆、使核酸充分提取出来。 酵母核酸中 RNA 含量较多。RNA 可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液 可以使解聚的核糖核酸沉淀。但蛋白质的存在干扰核酸的测定，因此在沉淀中加入 95%乙 醇溶液

14、洗涤，以除去蛋白，由此可得到 RNA 的粗制品。 RNA 在硫酸煮沸液中可水解成核糖、嘌呤硷、嘧啶硷和磷酸，可分别进行鉴定。核苷酸 核糖+（嘌呤碱 or 嘧啶碱）+磷酸。当含有核糖的 RNA 与浓盐酸及 3.5二羟基甲苯在沸水浴中加热后，有绿色复合物产生。这是因为 RNA 脱嘌呤后的核糖与酸作用生成醛糖，后者再与 3.5二羟基甲苯作用产生绿色络合物。可用比色法测定绿色复合物在 670 nm 有最大光吸收，故光吸收值与浓度成正比。三、实验器材1、器材：匀浆机、离心机、试管、烧杯、水浴锅。 2、试剂：酵母、酸性乙醇、95%乙醇、碱液、FeCl3 浓 HCl 液、苔黑酚。四、实验步骤 1、酵母 RN

15、A 的提取： 取酵母 1.0 g（5 片）加 0.04 M NaOH 8 ml倒入 10 ml 塑料离心管中，离心 （3000 rpm）10 min倾入小烧杯中缓慢加入 10ml酸性乙醇转移至10ml塑料离心管中离心 3 min（3000 rpm）研磨成 匀浆倒入玻璃试管中沸水浴 20 min去上清液,加 5 ml 95%乙醇（或乙醚）洗涤沉淀 RNA 离心 3 min（3000 rpm）得 RNA 粗品。RNA +HCl+ OHHOCH3 FeCl3 沸水浴沸水浴2、水解 RNA：将沉淀 RNA 转移到玻璃管中+10 ml 1.5 M H2SO4 3、RNA 组分鉴定： 嘌呤碱：取水解液 1

16、 ml + 浓氨水（5 滴）+1 ml AgNO3，观察嘌呤银化合物的絮状 沉淀。 核糖：取 1 ml 水解液+2 ml 苔黑酚三氯化铁溶液10 min 观察颜色变化（亮绿色）磷酸： 取 1 ml 水解液+1 ml 定磷试剂10 min 观察颜色变化（蓝色）4、RNA 含量测定（1）按下表加样操作标准管样品管空白管RNA 标准液0.5 mlRNA 样品水解液0.5 ml蒸馏水0.5 mlFeCl3 浓 HCl 液2 ml2ml2 ml苔黑酚： 0.2 ml0.2ml0.2 ml摇匀沸水浴 10 min沸水浴 10 min沸水浴 10 min取出冷却后 670 nm 比色 测定OD1OD2OD3（2）结果计算。RNA 标准液为 0.3 mg/ml。1 g 酵母片提取 RNA 的总体积为 10 ml。（OD1- OD3）/（OD2- OD3）=C标/C样RN