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1、干细胞论坛脂肪干细胞培养脂肪干细胞培养吸脂术时用无菌针管从臀上方吸取深层脂肪组织 20 mL. 在 1 h 内将其移至离 心管内，加入等量 PBS 缓冲液，充分振荡后低速离心 800 r/min10 min. 反 复冲洗 3 次后加入等量 15 g/L I 型胶原酶. 37水浴中充分振荡 30 min，再 加入等量胎牛血清（FBS）中止. 低速离心 10 min 后弃去上清. 将下层细胞用 PBS 悬浮后加入 16 mmol/L NH4Cl 37水浴中 10 min 以裂解红细胞. 低速离心 10 min 后再用 PBS 冲洗 3 次. 最后将细胞用含 100 mL/L FBS+10 g/L
2、青霉素的 DMEM 悬浮后移入培养瓶中，37，50 mL/L CO2 培养箱中孵育，48 h 后首次换 液，弃去悬浮细胞. 随后每 3 d 换液，1 wk 后传代. 将第 3 代细胞用于流式细 胞仪检测. 浓集细胞到 109/L 后进行流式细胞仪检测. 细胞传至第 3 代时将其 以 2107/L 的细胞数分别转入各定向培养基中进行培养. 诱导培养 2 wk 后， 对成脂诱导组进行油红脂肪颗粒染色，另外：现在脂肪干细胞缺乏特异的表面标志鉴定，各类文献提到脂肪干细胞表达阳性 的标志物 有：cd13，cd29，cd59，cd49e，cd73，cd90，HLA-ABC 等。但表达 阳性不代表具有特异性
3、，所以要从标志物上鉴定脂肪干细胞还 是很困难的，应 该说不具有很强的说服能力。按文献所说的步骤来提取脂肪干细胞，形态类似干细胞，并且具有多向分化的 能力，这就足以说明提取的细胞是干细胞。你要是想证明你养的就是干细胞， 最好的办法我认为还是做个多向诱导分化。干细胞传代干细胞传代吸出来以后，常速离心，用吸出来以后，常速离心，用 pbspbs 洗两遍后，洗两遍后，accutaseaccutase 管内管内消化消化 5-10min5-10min，加入基础培养基离心洗去消化液，分瓶传代。，加入基础培养基离心洗去消化液，分瓶传代。人脂肪干细胞的分离、体外培养及鉴定人脂肪干细胞的分离、体外培养及鉴定摘 要
4、目的: 进行人脂肪干细胞的分离、体外培养及鉴定, 为组织工程的进一步研究提供实验依据。方法: 将剪碎的人脂肪组织加入型胶原酶消化, 离心。将细胞悬液置于 6 孔培养板中, 37 、5 %CO2 培养箱中培养, 细胞达 80 %融合时进行传代。选取第 3 代细胞, 进行免疫组织化学染色, 检测细胞表面抗原标记物;选取第 3 代细胞, 分为成骨诱导组和成脂诱导组, 每组又分为诱导组(加入相应诱导培养基) 及对照组(未经诱导的细胞) 。成骨诱导 72 h 后进行碱性磷酸酶(A KP) 含量检测, 8 d 后进行茜素红染色, 检验细胞内是否出现钙沉积; 成脂诱导 2 周后进行油红 O 染色, 检测细胞
5、内是否形成脂滴。结果: 培养细胞均有 CD44 、CD49d 抗原阳性表达, 不表达 CD45 、CD106 抗原; 成骨诱导 72 h 后, 诱导组细胞内 A KP 含量(01488 3 U g - 1 prot )较对照组(01063 2 U g - 1prot) 明显增高( P 0105) ; 8 d 后诱导组茜素红染色阳性, 对照组阴性; 成脂诱导 2 周后油红 O 脂肪颗粒染色为阳性, 对照组为阴性。结论: 利用原代细胞培养技术可成功地从人脂肪组织中分离出脂肪干细胞。关键词 干细胞; 细胞分离; 细胞培养组织缺损是整形外科常见的疾病, 包括骨、软骨、脂肪等多种组织的缺损。自体组织移植
6、是目前最常用的方法, 但其主要问题包括容易坏死和吸收、组织量有限、供区瘢痕等, 因此往往无法达到预期治疗效果。组织工程是人体组织修复的理想方法, 其中种子细胞的选择非常重要。目前, 可被选用作为组织工程种子细胞的主要为各种类型的干细胞, 而成体干细胞中的脂肪干细胞( adipose2derived stem cell s , ASCs) 具备来源丰富、可反复取材、痛苦小、易扩增、能安全植入同体或异体等优点, 且无道德争议, 具有比骨髓干细胞更多的优点。因此 ASCs 是组织工程优秀的种子细胞。目前, 国内研究者对于 ASCs 的研究开展较晚, 且尚无系统应用于临床的报道。本研究通过原代细胞培养
7、技术, 对人 ASCs 进行分离、体外培养及鉴定,为今后组织工程的深入研究打下基础。1 材料与方法 实验材料 皮下脂肪组织 20 mL , 取自一名 35 岁健康女性, 由吉林大学第一医院整形外科手术切取。 试剂及仪器 高糖 DMEM 培养基( Gibco) ,标准胎牛血清(广州赛业) , 胰蛋白酶、型胶原酶、地塞米松、胰岛素、维生素 C、32 异丙基 212 甲基 2 黄嘌呤( IBMX) 、油红 O 染色剂、苏木精染色剂(Sigma) , 22 磷酸甘油(Amresco) , 吲哚美辛(临汾奇林药业) , 碱性磷酸酶(A KP) 检测试剂盒(南京建成生物) , CD44 、CD45 、CD
8、49 、CD106 多克隆抗体及辣根酶标记羊抗兔 IgG (北京博奥特生物) , 增强型 HRP2DAB 底物显色试剂盒( Tiangen) , 青霉素钠、链霉素。 细胞分离培养及传代 手术切取脂肪组织 2 h 内将脂肪组织送至实验室, 在超净台中将脂肪组织在 D2Hanks 液中漂洗 3 次, 尽量去除结缔组织及血管内皮, 将其剪成 1 mm 1 mm 1 mm 的组织块。将剪碎的组织置于高糖 DMEM 培养基中,加入 01075 %的型胶原酶, 置于 37 、5 %CO2 培养箱中培养 24 h 。将消化后的液体吸出, 移至离心管中, 2 200r min - 1 离心 6min , 弃上
9、层液体,D2Hanks 液重悬细胞, 离心, 重复 2 次。离心后弃掉漂浮的脂肪细胞及脂滴, 用含 20 %胎牛血清的高糖 DMEM 培养液重悬细胞, 置于 6 孔培养板中, 调整细胞密度为每孔 1 105 , 放入 37 、5 %CO2 培养箱中培养。24 h 细胞开始贴壁, 每 2 d 换液 1 次。当细胞达到 80 %融合时, 2 %的胰蛋白酶消化, 传代。脂肪组织中除脂肪外, 尚含有少量红细胞、白细胞、淋巴细胞、血管内皮及结缔组织, 以及来自血液的骨髓干细胞, 其中红细胞、白细胞、淋巴细胞可于换液时逐渐除去, 成纤维细胞及骨髓干细胞可应用细胞差速贴壁培养法进行去除。在倒置显微镜下对不同
10、生长时期的贴壁细胞直接进行细胞形态学观察, 应用显微镜软件进行拍照。 免疫组化染色 选取第 3 代细胞, 2 %胰酶消化, 接种于置有盖玻片的 6 孔板, 37 、5 %CO2 培养箱培养至贴壁, 进行免疫组化染色。 成脂诱导及检测 选取第 3 代细胞, 用胰液消化后, 接种到置有盖玻片的 6 孔培养板上, 每孔 105 个细胞, 在 37 、5 % CO2 条件下培养过夜。待细胞贴壁后, 将培养基更换为成脂诱导培养基(高糖 DMEM , 20 %FBS , 100 U mL - 1 青霉素,100 U mL - 1 链霉素, 1 mol L - 1 地塞米松,10mol L - 1 胰岛素,
11、 015 mmol L - 1 IBMX ,200mol L - 1吲哚美辛) , 每周换液 2 次, 并设立只加入对照培养基( 高糖 DMEM , 20 % FBS ,100 U mL - 1 青霉素, 100 U mL - 1 链霉素) 的孔为对照组。继续培养 2 周后, 分别取对照组和诱导组细胞进行油红 O 染色以证实细胞中是否有脂滴形成。 成骨诱导及检测 选取第 3 代细胞, 以每孔 1 105 个细胞接种到置有盖玻片的 6 孔板中, 37 孵育 24 h 。待细胞贴壁后, 加入成骨诱导培养基(高糖 DMEM , 20 %FBS , 100 U mL - 1 青霉素,100 U mL
12、- 1 链霉素, 10 mmol L - 1 22 磷酸甘油, 1mol L - 1 地塞米松, 50 mg L - 1 抗坏血酸磷酸钠) , 每周换液 2 次, 并设立只加入对照培养基的孔为对照组, 72 h 后进行 A KP 含量测定, 8 d 后进行茜素红染色。 统计学方法 A KP 含量组间比较采用 t 检验。2 结 果 细胞形态 细胞接种时, 含有大量的脂滴、少量红细胞和成纤维细胞等, 随着细胞贴壁后培养时间的延长, 换液次数的增加, 这些细胞基本被清除。接种 24 h 后, 可见少数较大的细胞开始贴壁,倒置显微镜下见细胞为大而扁平的单层细胞。有的细胞体细长, 似成纤维细胞。48 h
13、 后大多数细胞贴壁, 并开始伸展、分裂, 呈梭形, 有粗大突起。57 d 后, 细胞逐渐分裂、融合成单层, 成簇分布。传代后细胞呈梭形, 核居中, 多数为 1 个核仁, 也可双核, 呈圆形或卵圆形,混杂生长细胞随传代次数增加, 逐渐减少。平均扩增时间约为 60 h 。 细胞免疫组织化学染色 选取的第 3 代细胞进行免疫组化染色。免疫组化染色结果: 培养细胞有 CD44 、CD49d 抗原阳性表达,不表达 CD45 、CD106 抗原。 细胞诱导及检测 成脂诱导组: 选取第 3 代细胞, 进行成脂诱导, 2 周后, 胞内开始出现脂滴, 诱导组及对照组分别进行油红 O 染色,成脂诱导组油红 O 染
14、色阳性, 对照组为阴性。成骨诱导组: 选取第 3 代细胞, 进行成骨诱导, 72 h 后, 对照组及诱导组分别进行 A KP 含量测定。A KP (U g - 1 prot ) = 测定管吸光度/ 标准管吸光度标准管含酚的量/ 取样量中蛋白克数。对照组 AKP 含量为 01632 U g- 1 prot ,诱导组 A KP 含量为01488 3 U g - 1 prot , 诱导组 A KP 含量明显高于对照组, 两组比较差异有显著性( P 0105) 。成骨诱导 8 d 后, 对照组及诱导组分别进行茜素红染色, 诱导组染色阳性, 对照组为阴性。3 讨 论组织工程的基本原理和方法是将体外培养扩
15、增的正常组织吸附于生物相容性良好并可被机体吸收的支架上, 形成复合物, 再植入机体病损部位, 细胞在支架逐渐被机体吸收的过程中, 形成新的具有形态和功能的组织或器官, 达到修复创伤和重建功能的目的。由于组织工程可提供较多的组织量, 有望为较大范围的缺损提供解决方案。在种子细胞的选择上, 成体干细胞由于无伦理问题的争议, 更适合作为组织工程的种子细胞。在成体干细胞中, 对骨髓间充质干细胞(MSCs) 的研究开展较早, 目前已作为种子细胞进行组织工程的相关研究。但多数文献报道, 取骨髓时患者比较痛苦, 而且从骨髓中可获得的 MSCs 数量甚少, 需在体外进行扩增,以得到足够的细胞, 不仅周期长,
16、且扩增过程所需设备造价昂贵。ASCs 与其相比患者痛苦小, 细胞含量丰富, 每单位体积脂肪组织中含有多分化潜能细胞的数量是骨髓组织的 1001 000 倍, 不需进行长期的体外扩增, 具有多方向分化潜能。因此,ASCs 更适合作为组织工程的种子细胞。由脂肪组织获得的单细胞悬液中, 最基本的细胞是脂细胞, 此外还存在少量成纤维细胞和从血管运输来的 MSCs。与 ASCs 相比, 成纤维细胞贴壁迅速, 生长速度快, 会抑制目的细胞的增殖; 而 MSCs 将会影响鉴定结果, 这两种细胞一旦贴壁,对实验结果影响很大。因此, 彻底去除成纤维细胞和 MSCs , 是实验成功的重要步骤。与 ASCs 相比,大部分成纤维细胞和 MSCs 在 3060 min 内可完成贴壁过程, 且不易被胰酶消化, 利用这一特点,用细胞外基质差速贴壁法去除以上两种细胞, 效果较好。此法在表皮干细胞等的分选中的应用证实是一种简单有效的干细胞分选办法。目前, ASCs 尚未发
