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1、 分享分享 蛋白质含量测定方法比较蛋白质含量测定方法比较蛋白质, 含量, 测定蛋白质含量测定方法比较本实验的目的是学会各种蛋白质含量的测定方法。了解各种测定方法的基本原理和优缺点。蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（Biuret 法）、Folin酚试剂法（Lowry 法）和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford 法）。其中 Bradford 法和 Lowry 法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏 1020 倍，比 Biuret 法灵敏 100 倍以上。定氮法虽然比较复杂
2、，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。值得注意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质，因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：实验对测定所要求的灵敏度和精确度；蛋白质的性质；溶液中存在的干扰物质；测定所要花费的时间。考马斯亮蓝法（Bradford 法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。一、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被
3、中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下：CH2COOH| + 3H2SO4 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1)NH22NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4 (2)(NH4)2SO4 + 2NaOH 2H2O +Na2SO4 + 2NH3 (3)反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。为了加速消化，可以加入 CuSO4 作催化剂，K2SO4 以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。计算所得结果为样品总氮量，如欲求得 样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含
4、量，即用样品中蛋白氮乘以 625 即得。五种蛋白质测定方法比较如下：方法 灵敏度 时间 原理 干扰物质 说明 凯氏定氮法（Kjedahl 法） 灵敏度低，适用于 0.2 1.0mg 氮，误差为 2 费时 810 小时 将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定 非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离） 用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少；费时太长 双缩脲法（Biuret 法） 灵敏度低120mg 中速 2030 分钟 多肽键碱性 Cu2紫色络合物 硫酸铵；Tris 缓冲液；某些氨基酸 用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似 紫外吸收法 较为灵敏50100mg 快速 510 分钟 蛋白质中的酪氨酸
5、和色氨酸残基在 280nm 处的光吸收 各种嘌吟和嘧啶；各种核苷酸 用于层析柱流出液的检测；核酸的吸收可以校正 Folin酚试剂法（Lowry 法）灵敏度高5mg 慢速 4060分钟 双缩脲反应；磷钼酸磷钨酸试剂被 Tyr 和 Phe 还原 硫酸铵；Tris 缓冲液；甘氨酸；各种硫醇 耗费时间长；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化 考马斯亮蓝法(Bradford 法) 灵敏度最高15mg 快速515 分钟 考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其 lmax 由 465nm 变为 595nm 强碱性缓冲液；TritonX-100;SDS 最好的方法；干扰物质少；颜色稳定； 颜色深浅随不同蛋白质变化
6、 二、双缩脲法（Biuret 法）（一）实验原理双缩脲（NH3CONHCONH3）是两 个分子脲经 180左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与 CuSO4 形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。H2OO=C C=OHN NHR-CH CH-RO=C Cu C=OHN NHR-CH CH-RH2O紫色络合物紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为 110mg 蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris 缓冲
7、液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速 ，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。（二）试剂与器材1. 试剂：（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml 的标准蛋白溶液，可用 BSA 浓度 1mg/ml 的 A280 为 0.66 来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用 H2O 或 0.9%NaCl 配制，酪蛋白用 005N NaOH 配制。（2）双缩脲试剂
8、：称以 1.50 克硫酸铜（CuSO45H2O）和 6.0 克酒石酸钾钠（KNaC4H4O64H2O），用 500 毫升水溶解，在搅拌下加入 300 毫升 10% NaOH 溶液，用水稀释到 1 升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。2. 器材：可见光分光光度计、大试管 15 支、旋涡混合器等。（三）操作方法1. 标准曲线的测定：取 12 支试管分两组，分别加入 0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到 1 毫升，然后加入 4 毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（2025）下放置 30 分钟，
9、于 540nm 处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。2、样品的测定：取 23 个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过 10mg/ml。三、Folin酚试剂法（Lowry 法）（一）实验原理这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难（现在已可以订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即 Folin酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色
10、反应产生深兰色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。Folin酚试剂中的磷钼酸盐磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。Folin酚试剂法最早由 Lowry 确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰 Lowry 反应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris 缓冲液、甘
11、氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素（0.5%），硫酸纳（1%），硝酸纳（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠氢氧化钠溶液，即可显色测定。若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠氢氧化钠溶液的浓度 12 倍。进行测定时，加 F olin酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性 pH 条件下稳定，但上述还原反应只在 pH=10 的情况下发生，故当 Folin 一酚试剂加到碱性的铜蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸磷钨酸试剂 被破坏之前，还原反应即能发生
12、。此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。此法可检测的最低蛋白质量达 5mg。通常测定范围是 20250mg。（二）试剂与器材1.试剂（1）试剂甲：（A） 10 克 Na2CO3，2 克 NaOH 和 0.25 克酒石酸钾钠 （KNaC4H4O64H2O）。溶解于 500毫升蒸馏水中。（B） 0.5 克硫酸铜（CuSO45H2O）溶解于 100 毫升蒸馏水中，每次使用前，将 50 份（A）与 1 份（B）混合，即为试剂甲。（2）试剂乙：在 2 升磨口回流瓶中，加入 100 克钨酸钠（Na2WO42H2O）,25 克钼酸钠（Na2MoO42H2O）及 700 毫升蒸馏水，再加 50 毫升 85%磷
13、酸，100 毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流 10 小时，回流结束时，加入 150 克 硫 酸 锂（Li2SO4），50 毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾 15 分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至 1 升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准 NaOH 滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水 1 倍，使最终的酸浓度为 1N 左右。（3）标准蛋白质溶液:精确称取结晶牛血清清蛋白或 g球蛋白，溶于蒸馏水，浓度为 250 mg/ml 左右。牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用 0.9 % NaCl 溶液。2. 器材（1）可见
14、光分光光度计（2）旋涡混合器（3）秒表（4）试管 16 支（三）操作方法1. 标准曲线的测定：取 16 支大试管，1 支作空白，3 支留作未知样品，其余试管分成两组，分别加入 0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 毫升标准蛋白质溶液（浓度为250mg/ml）。用水补足到 1.0 毫升，然后每支试管加入 5 毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温（2025）放置 10 分钟。再逐管加入 0.5 毫升试剂乙（Folin酚试剂），同样立即混匀。这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置 30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于 700nm 处测定各管中
15、溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。注意：因 Lowry 反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即第 1 支试管加入 5 毫升试剂甲后，开始计时，1 分钟后，第 2 支试管加入 5 毫升试剂甲，2 分钟后加第 3 支试管，余此类推。全部试管加完试剂甲后若已超过 10 分钟，则第 1 支试管可立即加入 0.5 毫升试剂乙，1 分钟后第 2 支试管加入 0.5 毫升试剂乙，2 分钟后加第 3 支试管，余此类推。待最后一支试管加完试剂后，再放置 30 分钟，然后开始测定光吸收。每分钟测一个样品。进行多试管操作时，为了防止出错，每位学生都必须在实验
16、记录本上预先画好下面的表格。表中是每个试管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的顺序，逐管加入。最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量（微克）和测得的吸光度值。Folin酚试剂法实验表格：管号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 标准蛋白质 0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 （250mg/ml） 未知蛋白质 0.2 0.4 0.6（约 250mg/ml）蒸馏水 1.0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.8 0.6 0.4试剂甲 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0试剂乙 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5每管中蛋白质的量（mg）吸光度值（A700） 2. 样品的测定：取 1 毫升样品溶液（其中约含蛋白质 20250 微克），按上述方法进行操作，取 1 毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起，同时进行
