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1、1 实验二 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳法 （SDS-PAGE ）测定蛋白质的分子量1 原理1.1 聚丙烯酰胺凝胶的性能及制备原理1.1.1性能聚丙烯酰胺凝胶的机械性能好，有弹性，透明，相对地化学稳定，对pH 和温度变化比较稳定， 在很多溶剂中不溶， 是非离子型的， 没有吸附和电渗作用。 通过改变浓度和交联度， 可以控制孔径在广泛的范围内变动，并且制备凝胶的重复性好。 由于纯度高和不溶性，因此还适于少量样品的制备，不致污染样品。1.1.2 制备原理聚丙烯酰胺凝胶是用丙烯酰胺（Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂的作用下聚合而成。 聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化系统有化学聚合和光聚合两种。
2、本实验是用化学聚合。化学聚合的催化剂通常多采用过硫酸铵（AP）或过硫酸钾，此外还需要一 种脂 肪族叔 胺作加 速剂 ，最有 效的加 速剂 是 N,N,N,N-四甲基乙二胺（TEMED） 。在叔胺的催化下， 由过硫酸铵形成氧的自由基，后者又使单体形成自由基，从而引发聚合反应。叔胺要处于自由碱基状态下才有效，所以在低pH 时，常会延长聚合时间； 分子氧阻止链的延长， 妨碍聚合作用； 一些金属也能抑制聚合； 冷却可以使聚合速度变慢。 通常控制这些因素使聚合在1 小时内完成， 以便使凝胶的性质稳定。1.1.3 凝胶浓度和交联度与孔径的关系凝胶浓度根据被分离的物质的分子量大小确定。当分析一个未知样品时，
3、常先用7.5%的标准凝胶或用410%的凝胶梯度来试测，而后选出适宜的凝胶浓度。凝胶的机械性能、弹性是否适中很重要，胶太软易断裂，；太硬则脆，也易折断。1.2 SDS-凝胶电泳法测定蛋白质分子量的原理蛋白质分子在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于所带净电荷及分子的大小和形状等因素。如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入SDS 和巯基乙醇，则蛋白质分子的迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。在蛋白质溶液中加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原；SDS 能使蛋白质的氢键、 疏水键打开， 并结合到蛋白质分子上， 形成蛋白质 -SDS复合物。 SDS 与蛋白质的结合带来
4、两个后果：第一，使各种蛋白质的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别，使所有的SDS-2 蛋白质复合物在电泳时都以同样的电荷蛋白质比向正极移动；第二，SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。这两个原因使蛋白质-SDS 复合物在凝胶电泳中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是蛋白质分子量的函数。选择一系列不同分子量的球形或基本呈球形的蛋白质作为标准物，使其形成 SDS复合物。把这些复合物在相同条件下进行电泳分离，分子量小的物质泳动距离大， 分子量大的物质泳动距离小。 测定出相对泳动率， 用相对泳动率对蛋白质的分子量的对数作图，它们在一定范围内
5、呈直线关系。因此可作为标准曲线来检测样品蛋白质的分子量。1.3 染色原理常用的染料主要有氨基黑10B、考马斯亮蓝 R250、考马斯亮蓝G250、1-苯胺基-8-萘磺酸，各有优缺点，本实验选用考马斯亮蓝R250，它的染色灵敏度比氨基黑高5 倍，尤其适用于 SDS电泳微量蛋白质染色。2试剂与器材2.1 试剂2.1.1 （1 号液）凝胶贮备液丙烯酰胺（ Acr）29.2 g 甲叉双丙烯酰胺（ Bis）0.8 g 加蒸馏水至100 mL 2.1.2 （2 号液）浓缩胶缓冲液（ 0.5molL Tris-HCl 缓冲液， pH 6.8）三羟甲基氨基甲烷（ Tris）6g 加蒸馏水约 50 mL，溶解后以
6、 6molL HCl 调到 pH 6.8，定容至 100 mL 2.1.3 （3 号液）分离胶缓冲液（ 1.5 molL Tris-HCl 缓冲液， pH 8.8）三羟甲基氨基甲烷（ Tris）18.15 g 加蒸馏水约 50 mL 溶解后以 6molL HCl 调到 pH 8.8 加蒸馏水至100 mL 2.1.4 （4 号液） 10% 十二烷基硫酸钠（ SDS）水溶液SDS*（电泳用）1.0 g 蒸馏水10.0 mL 2.1.5 （5 号液）过硫酸铵（ APS）溶液3 过硫酸铵100 mg 蒸馏水1.0 mL 临用前配置2.1.6 （6 号液） N,N,N,N-四甲基乙二胺（ TEMED）
7、2.1.6 电泳缓冲液Tris 3 g 甘氨酸14.4 g 4 号液10ml 加蒸馏水至1 000 mL 2.1.5 样品缓冲液2 号液0.5 mL 4 号液4 mL 甘油2 mL -巯基乙醇1 mL 0.04% 溴酚蓝0.5 mL 加水至 10mL 2.1.9 染色剂考马斯亮蓝 R250 0.31g 甲醇125mL 乙酸25mL 蒸馏水100mL 2.1.10 脱色剂甲醇250mL 乙酸50mL 蒸馏水200mL 2.1.11 保存液7%乙酸水溶液2.1.12 SDS-PAGE低分子量标准蛋白质蛋白质名称分子量（ MW）兔磷酸化酶 B 97400 牛血清白蛋白66200 兔肌动蛋白43000
8、 4 牛碳酸酐酶31000 胰蛋白酶抑制剂20100 鸡蛋清溶菌酶14400 2.2 器材电泳仪，垂直板电泳槽， 酸度计， 电导仪，分析天平，真空泵，高速台式离心机，微量加样器，染色槽，电炉。3 实验步骤3.1 制备电泳分离胶根据样品分子量的大小， 配制所需浓度的分离胶。 10100 K 分子量的样品， 宜采用 T=12%的胶， 40200 K 分子量的样品宜采用T=7.5%的胶。本实验采用T=10%的胶，具体配方如下：分离胶：1 号液10mL 3 号液7.5 mL 4 号液0.3 mL 蒸馏水12 mL 6 号液18L 5 号液180L 按顺序配制，加完6 号液后暂时停下来，临用时再加5 号
9、液，混匀后立即装入制胶槽，约 60 min 后就可以凝固。3.2 制备电泳浓缩胶（ T=0.38%）浓缩胶：1 号液1.33 mL 2 号液2.5 mL 4 号液0.1mL 蒸馏水6.1mL 6 号液5L 5 号液0.1mL 按顺序配制，加完6 号液后暂时停下来，临用时再加5 号液，混匀后立即装入制胶槽，约 30 min 后就可以凝固。3.3 制备凝胶板5 制备凝胶板前先用无水乙醇擦拭玻璃板内面。用 2.5%琼脂封边，并用蒸馏水检验是否密封完好。密封好后用吸管缓慢加入分离胶，离顶端约1.5 cm 时注入蒸馏水。待界面清晰后， 吸去蒸馏水， 用吸管吸取配好的浓缩胶冲洗凝固的分离胶面，插入样品槽模
10、板， 用吸管缓慢注入浓缩胶。 待凝固好后， 在玻璃板上用记号笔划出点样槽底线，轻轻拔出样品槽模板。3.4 样品制备称取脱盐或冻干的蛋白0.01g，加 1mL 蒸馏水溶解后， 10000rpm 离心 5min，吸取上清 50L 加等体积的样品缓冲液，沸水浴加热3min，取出瞬间离心，上清液备用。3.5 标准蛋白制备方法同样品制备，本实验的标准蛋白已经制备好，解冻后直接加样即可。3.6 加样用加样器分别取已高速离心过的样品液的上清液5、10、15L，依次加到三个样品槽的底部。 用加样器分别取标准蛋白质10、20L， 依次加到三个样品槽的底部，标准蛋白泳道的两侧各加10L 样品缓冲液作空白对照。 并
11、作好记录以免混淆。 上好样后缓慢往样品槽中加入电极缓冲液，注意不要有气泡。3.7 电泳连接电泳仪的直流电源，正极连在凝胶板的下端，负极连在凝胶板的上端，即有样品的一端。电流值恒为10mA。大约经过 45 h，样品缓冲液中的溴酚蓝指示剂到达离凝胶底部 0.5 cm 处，关闭电源，取下电泳板，并将两片玻璃板分开，将凝胶板小心移入染色槽中。3.8 染色、脱色加染色剂染色过夜。倾去染色液，加脱色剂将背景的蓝色脱尽，中间要更换数次脱色固定液，然后将凝胶板制成干板、扫描。3.9 测量相对泳动率Rm值，计算分子量测量溴酚蓝的泳动距离，将它作为相对泳动率的标准1.0。测量标准分子量蛋白质的泳动距离，算出它们的
12、Rm值（Rm=样品迁移距离染料迁移距离） 。以分子量的对数值为横坐标， Rm值为纵坐标，将标准分子量蛋白质的坐标点连为一条直线，即得标准曲线。算出样品蛋白质的Rm值，从标准曲线上查出其分子量的对数值，换算出分子量。4实验结果作出标准曲线及换算样品蛋白质分子量6 图 1 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量的电泳图谱图 1 中， 标准蛋白产生的 6 条条带分别标记为 a、b、c、d、e、f，卵清蛋白产生的两条条带分别标记为A、B；人血清蛋白产生的三条带分别标记为C、D、E。5、10 分别指样品蛋白质加样量；在图中测量出下列值：溴酚蓝的泳动距离D= 9.7; 标准蛋白的泳动距离：Da =1.0；Db
13、 =1.5；Dc =2.6；Dd =3.7；De =5.1；Df =6.2。标准蛋白的相对泳动率： Ra =0.103 ；Rb =0.155；Rc =0.268 ；Rd =0.381；Re =0.526 ；Rf =0.639。卵清蛋白的泳动距离： DA =1.7；DB =3.4；人血清蛋白的泳动距离： DC =1.9；DD =4.2；DE =4.9。样品蛋白质的相对泳动率： RA=0.175； RB =0.351 ； RC =0.196 ； RD =0.433； RE=0.505 。(Rm=Dm/D) 表 1 标准蛋白的 lgMW 与 Rm值a b c d e f Rm0.639 0.526
14、0.381 0.268 0.155 0.103 lgMW 4.15 4.30 4.49 4.63 4.82 4.99 各条带对应的标准蛋白分子量的对数值与相对迁移率见表1。根据表 1，以标准分子量的对数值（ lgMW）为横坐标，相对迁移率（Rm）为纵坐标，将标准蛋白质的坐标点连为一条直线， 即得标准曲线（图 2） ， 并根据此曲线得趋势线公式： y= -0.1116x + 0.7359， 由该公式计算出样品蛋白质中各个条带相对应的蛋白质样品分子量对数值，换算出分子量（表2） 。5 讨论1.卵清蛋白中分离出2 种蛋白质，分子量分别为 106169.6和 2811.9 ；人血清蛋白中分离出三种蛋白
15、质，分子量分别为68865.2、517.6和 116.9。C D E 7 图 用低分子量标准蛋白所做的标准曲线y = -0.1116x + 0.7359 00.10.20.30.40.50.60.701234567表 2 样品蛋白质的Rm值、 lgMW 和分子量（ MW ）卵清蛋白人血清蛋白A B C D E Rm0.175 0.351 0.196 0.433 0.505 lgMW 5.026 3.449 4.838 2.714 2.068 MW 106169.6 2811.9 68865.2 517.6 116.9 2. 电泳条带的粗细能定性的反映样品中蛋白质含量的相对多少，所以在本实验中，
16、卵清蛋白所得的2 条带中， ，B 条带是我们所提取的卵清蛋白的条带；人血清蛋白所得的 3 条条带中， C 条带是我们所提取的人血清蛋白的条带。3.实验所得蛋白质分子量与实际分子量相差较大，即测量值与真实值相差较大，原因可能如下：1）实验过程中测量的不准确； 2）分子量的测定不能完全依赖SDS-PAGE ，因为一些蛋白质的迁移是不规则的；3) 要做到非常严谨的测定蛋白质分子量，至少应在两个不同的丙烯酰胺凝胶浓度下进行电泳；4）从图 1 上看，样品蛋白质的两种加样量的泳道上都产生了很粗的条带，这可能是由于样品浓度太大， 给迁移位置的测量造成了困难，这也是造成结果误差的一个原因；5）干胶后引起蛋白质带变宽，尤其是厚胶难以准确对蛋白质和指示剂前沿定位。3. 每空的上样量不能过大，以免样品溢出，造成各泳道相互污染。4. 为了避免边缘效应，在未加样的泳道加入等量的样品缓冲液。5. 加样的过程中，个别样品不能沉到加样孔底部。其原因可能是：样品缓冲液中没8 有足够的甘油， 或梳子安放的不合适， 使孔底留有聚合的丙烯酰胺，本实验中后面一个原因的存在的可能
