《早期干预对宫内感染致脑损伤仔鼠神经干细胞增殖能力的影响》由会员分享，可在线阅读，更多相关《早期干预对宫内感染致脑损伤仔鼠神经干细胞增殖能力的影响（6页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1早期干预对宫内感染致脑损伤仔鼠神经 干细胞增殖能力的影响【摘要】 目的 研究早期干预对宫内感染致脑损伤新生大鼠内源性神经干细胞原位增殖能力的影响。方法 30 只孕 17 d 大鼠连续 2 d 腹腔注射脂多糖(450 g/kg)，设为脂多糖组,制备宫内感染脑损伤动物模型，生理盐水组 6 只注射等量生理盐水。将脂多糖组所产足月新生仔鼠用随机数字表法分为损伤组和训练组，生理盐水组所产仔鼠为对照组，每组各 30 只。对训练组进行早期干预至日龄 28 d,对照组、损伤组常规饲养;选取 1，3，7，14，28 d 各组仔鼠用免疫组织化学方法动态检测海马齿状回颗粒层，BrdU 阳性细胞的表达。结果 (1)
2、出生后 1 d 对照组、训练组、损伤组新生大鼠海马齿状回颗粒层均存在 BrdU，对照组显著高于训练组、损伤组(P0.01)。(2)对照组 BrdU 阳性细胞数 3 d 开始增加，7 d 达到高峰，14 d 后下降，28 d 接近正常成年大鼠水平。(3)早期丰富环境刺激后，训练组大鼠海马齿状回颗粒层 BrdU 阳性细胞数在 3 d 开始增加，14 d 达高峰，峰值显著高于对照组水平(P0.01)，28 d 后下降，但仍高于对照组，BrdU 阳性细胞数在时间上均呈一过性增高表达。结论 宫内感染致大鼠脑损伤可导致内源性神经干细胞增殖能力降低，并较长时间内难以自然恢复;早期干预可激活脑损伤鼠内源性神经
3、干细胞原位增殖能力，推迟高峰出现，延长作用“时间窗”。 【关键词】 脑损伤; 宫内感染; 神经胶质增生; 干预; 大鼠; 动物，实验【Abstract】 Objective To study the impact of early intervention on proliferation of neural stem cells in brain damage rats after intrauterine infection.Methods Totally 36 Wistar pregnant rats were randomly divided into two groups:LPS(n
4、=30) and saline(n=6).Pregnant rats were consecutively injected with LPS(450 g/kg) or saline 2on gestation 17 d.Saline neonatal rats were randomly selected as saline group N(n=30),LPS neonatal rat as training group T(n=30) and injury group I(n=30).The 1 d T group rats were interfered by early interve
5、ntiont.At the same time,the N,I group rats were fed in the routine way.The expression of bromodeoxyuridind(BrdU) were determined by immunohistochemistry at 1，7，14，28 d of all groups.BrdU was used to mark dividing neural stem cells(NSCs) in hippocamp dentate gyrus subgranular zone(SGZ).Results (1)Brd
6、U labeled cells could be observed in all groups;I groups and T groups were markedly less than N group(P0.01).(2)The number of positive cells of N group increased at 3 day(P0.05),approximately six fold with a peak at 7 day,markedly decreased at 28 day and approched normal level of mature rats.(3)Comp
7、ared with the N group,the number of positive cells of T group increased strikingly at 3 day(P0.01),exceeding N group and approximately six fold with a peak at 14 day,then gradually decreased,but still higher than N group at 28 day.The appearance of increasing peak in T group was lengthened，value asc
8、ended.Conclusions Our results indicate that the brain damage caused by intrauterine infection can lead to the decrease of proliferation of inherent NSCs.The damage will not recover itself.Early intervention can stimulate the proliferation of inherent NSCs.Early period enriched environment can prolon
9、g the development window phase of inherent NSCs.【Key words】 Brain damage; Intrauterine infection; Glial proliferation; Intervention; Rat; Animal，experiment神经干细胞(neural stem cells,NSCs)在一定病理条件和干预作用下可以增殖、分化成神经元和神经胶质细胞，参与修复缺损的神经功能1。脑性瘫痪(简称脑瘫)是指出生前到出生后发育时期非进行性脑损伤所致综合征，是继小儿麻痹后儿童肢体严重残疾的主要疾病之一，孕期感染所致的脑损伤是脑
10、瘫的高危因素2。因此,探讨宫内感染致脑损伤的发生机制，控制病情发展已经成为当前研究中的重点。本研究旨在观察早期干预对宫内感染致脑损伤后内源性 NSCs 的反应过程，为脑损伤后机体自我修复提供理论依据。1 材料与方法1.1 实验动物与试剂 清洁级成熟 Wistar 大鼠 60 只，雌性 40 只，雄性 20 只，体质量 180240 g，由佳木斯大学实验动物中心提供。脂多糖(脂多糖血清型3055：B5，美国 SIGMA 公司)。5BrdU 免疫组织化学试剂盒(北京博奥森生物工程有限公司)。1.2 动物模型制备与分组 运用李晓捷等3所建的宫内感染致脑损伤动物模型，将研究对象常规饲养,饮食自由,明暗
11、周期 12 h/12 h,室温(183)。于下午 17 时以21 合笼,次日上午 8 时查阴道涂片,查到精子记为妊娠 0 d,孕鼠另笼饲养。随机数字表法选取孕鼠分为脂多糖组 30 只和生理盐水组 6 只。脂多糖组孕 17 d 大鼠连续 2 d 腹腔注射脂多糖,剂量为每次 450 g/kg;生理盐水组大鼠腹腔注射等量生理盐水。观察两组大鼠的分娩时间,孕 22 d 前分娩的仔鼠为早产鼠,去除早产鼠。仔鼠出生后，取胎盘做苏木精伊红染色观察宫内感染情况。将脂多糖组所产足月新生仔鼠用随机数字表法分为损伤组、训练组，生理盐水组所产仔鼠为对照组，每组各 30 只。设生后 1，3，7，14，28 d 5 个时
12、间点，每个时间点 6 只，测定 BrdU 水平变化，进一步分析探讨早期干预对脑损伤内源性 NSCs增殖能力的影响机制。1.3 早期干预方法1.3.1 早期触摸 在仔鼠出生后 213 d，每日将训练组仔鼠与母鼠分开 1 次，用毛刷从头至尾沿脊柱轻轻地摩擦，持续 15 min。1.3.2 早期丰富环境 早期触摸第 7 天始，给予训练组仔鼠丰富环境刺激，参照国内外文献设计4，5，在 70 cm60 cm50 cm 的大笼内放置不同颜色、形状及气味的物体。包括各种质感的砂纸、毛刷，冰冷的金属和有刺激性气味的柠檬、薄荷棉球。还有转盘、管道、斜坡、秋千、跷跷板、小球等“玩具”，并配以舒缓的轻音乐。训练组仔
13、鼠每日放入笼内 4 次，每次 10 min，每周将环境改变 2 次，以造成新异4的刺激，总干预时间为 21 d。对照组和损伤组分别饲养于 20 cm30 cm45 cm 标准笼内，不予早期干预。1.4 BrdU 标记和染色1.4.1 BrdU 标记 BrdU 溶于 0.01%磷酸盐缓冲液，50 mg/kg 腹腔注射，共分 2次，间隔 6 h。术后 1 d 麻醉后处死。剥离头皮，沿前囟剪开颅骨，取出大脑，将其泡置于 40 g/L 多聚甲醛(4 )，固定，常规脱水，石蜡包埋，切片从视交叉冠状面到海马，片厚 5 m，每 5 张取 1 张，每标本取 10 m，行 BrdU 免疫组织化学染色。1.4.2
14、 BrdU 免疫组织化学染色 首先用 50%甲酰胺和柠檬酸钠在 65 下处理脑组织切片 2 h，行 DNA 变性;3%过氧化氢，室温 510 min 以灭活内源性酶;滴加正常山羊血清工作液，加小鼠抗 BrdU 单克隆抗体(1100 倍)，室温，孵育 23 h;加生物化二抗(生物素化山羊抗兔 IgG);加过辣根酶链霉卵白素工作液，室温孵育1015 min;磷酸盐缓冲液冲洗;联苯胺染色，苏木精复染。1.5 BrdU 免疫组织化学结果判定 光镜(1020)下以细胞核内有棕褐色或棕黄色颗粒且密度不均者为 BrdU 阳性细胞，观察阳性细胞在脑内分布情况;在显微镜400 倍视野下计数阳性细胞,共计数 5
15、个视野,取其平均值。计算机图像分析系统软件(Image macro 4.0)计数脑损伤后不同时间段海马齿状回颗粒层阳性细胞。1.6 统计学方法 实验数据以s 表示。采用 SPSS 13.0 统计软件进行统计。两5样本均数两两比较采用 LSDt 检验，多样本均数两两比较采用 q 检验。检验水准取 =0.05。2 结果2.1 各组 BrdU 阳性细胞数变化结果 BrdU 定位于细胞核，为棕色颗粒状，标记的是全部的新生细胞，训练组、损伤组、对照组大鼠海马齿状回颗粒层周边均存在 BrdU 阳性细胞，对照组出生 1 d 大鼠的数量较多，排列较为规律，显著高于损伤组及训练组(P0.01);损伤组及训练组
16、BrdU 阳性细胞数量稀少，无明显差异。见图 1。2.2 对照组 BrdU 阳性细胞数各时间点变化结果 对照组 BrdU 阳性细胞数在出生 3 d 开始增加，7 d 达到高峰，14 d 后下降，28 d 接近正常成年大鼠水平。见表 1。2.3 早期干预后各时间点各组 BrdU 阳性细胞数变化结果 早期干预后，训练组大鼠海马齿状回颗粒层 BrdU 阳性细胞数在 3 d 开始增加，14 d 达高峰，峰值显著高于对照组水平(P0.01)，28 d 后下降，但仍高于对照组，BrdU 阳性细胞数在时间上均呈一过性增高表达。见表 1。 表 1 各时间点各组 BrdU 阳性细胞数变化注：与对照组比较，aP0.05，bP0.01;与训练组比较，cP0.05，dP0.01。 3 讨论近年来随着围产技术的迅猛发展,未成熟儿的成活率大大提高,早产、低出生体重儿致脑瘫呈上升趋势6。脑瘫的主要病理类型包括：脑室周围白质软化、脑室周围白质出血及梗死,以前者更为多见2，目前的研究亦着重于此。然而，虽然对可能
