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1、一步法和两步法一步法和两步法RT-PCR的根本区的根本区别别？答：有中间产物cDNA，但稍微麻烦一点；一步法简单，但得不到cDNA。两步法两步法一步法同两步法一步法同两步法RT-PCR的比的比较较:两步法RT-PCR比较常见，在使用一个样品检测多个mRNA时比较有用。然而一步法RT-PCR具有其他优点。一步法RT-PCR在处理大量样品时易于操作，有助于减少残余污染，因为在cDNA合成和扩增之间不需要打开管盖。一步法可以得到更高的灵敏度，最低可以达到0.1pg总RNA，这是因为整个cDNA样品都被扩增。对于成功的一步法RT-PCR，一般使用反义的基因特异性引物起始cDNA合成。210增加RT-P
2、CR特异性第一链cDNA合成的起始可以使用三种不同的方法，各种方法的相对特异性影响了所合成cDNA的量和种类。随机引物法是三种方法中特异性最低的。引物在整个转录本的多个位点退火，产生短的，部分长度的cDNA。这种方法经常用于获取5末端序列及从带有二级结构区域或带有逆转录酶不能复制的终止位点的RNA模板获得cDNA。为了获得最长的cDNA，需要按经验确定每个RNA样品中引物与RNA的比例。随机引物的起始浓度范围为50到250ng每20l反应体系。因为使用随机引物从总RNA合成的cDNA主要是核糖体RNA，所以模板一般选用poly(A)+RNA。Oligo(dT)起始比随机引物特异性高。它同大多数
3、真核细胞mRNA 3端所发现的poly(A)尾杂交。因为poly(A)+RNA大概占总RNA的1%到2，所以与使用随机引物相比，cDNA的数量和复杂度要少得多。因为其较高的特异性，oligo(dT)一般不需要对RNA和引物的比例及poly(A)+选择进行优化。建议每20l反应体系使用0.5g oligo(dT)。oligo(dT)12-18适用于多数RT-PCR。ThermoScript RT-PCR System提供了oligo(dT)20，因为其热稳定性较好，适用于较高的保温温度。基因特异性引物（GSP）对于逆转录步骤是特异性最好的引物。GSP是反义寡聚核苷，可以特异性地同RNA目的序列杂
4、交，而不象随机引物或oligo(dT)那样同所有RNA退火。用于设计PCR引物的规则同样适用于逆转录反应GSP的设计。GSP可以同与mRNA3最末端退火的扩增引物序列相同，或GSP可以设计为与反向扩增引物的下游退火。对于部分扩增对象，为了成功进行RT-PCR，需要设计多于一个反义引物，因为目的RNA的二级结构可能会阻止引物结合。建议在20l的第一链合成反应体系中使用1pmol反义GSP。RT-PCR实验实验步步骤骤： ：一、组织抽提：一、组织抽提：1. 取组织块50-100用液氮在研钵中研磨成粉末2. 移入玻璃匀浆器加入1ml Trizol抽打匀浆3. 移入1.5ml新离心管用5 ml针头抽打
5、4. 冰上孵育5分钟5. 离心12,000g 4 5分钟 取上清液移入1.5ml新离心管6. 加0.2 ml氯仿，震荡，冰上孵育5分钟7. 离心12,000g 4 10分钟 取上层液相移入1.5ml新离心管8. 加0.5 ml异丙醇，震荡，冰上孵育5分钟9. 离心12,000g 4 5分钟 弃去上清液10. 加入1 ml 75%乙醇，震荡11. 离心7,500g 4 5分钟 弃去上清液12. 室温下使之变透明13. 加入DEPC处理水10l -35l溶解RNA（ 可保存在液氮或低温冰箱）14. 走RNA变性电泳观察18s，28s条带，分光光度计检测260/280吸光度 比值，计算RNA浓度二、
6、二、RT反应体系（第一步）：约反应体系（第一步）：约20分钟分钟RNA 抽提物5l Radome 引物2l RNA sin0.5l1. 65 15分钟2. 立即放入冰浴RT反应体系（第二步）：约反应体系（第二步）：约2小时小时RNA sin0.5l 10mM dNTP1l 5RT 缓冲液4l 25mM MgCl24l AMV 逆转录酶3l1. 37 1.5小时2. 94 5-10分钟3. 反应物保存于-20或进行PCR三三1、PCR反应体系：约反应体系：约4.5小时小时25mM MgCl22l 10PCR缓冲液5l 10mM dNTP1l 上下游引物10pmol/l2.5l2 CDNA模板2.
7、5l ddH2O34l Taq酶0.5l 轻质石蜡油50l100l1. 94 2分钟，55 1分钟，72 2分钟 为第一个步1个循环2. 94 45秒，55 40秒，72 1分钟 为第二步30个循环3. 72 10分钟4. 取出后4 5分钟后-20保存或走电泳三三2、PCR反应体系：约反应体系：约5小时小时25mM MgCl23l 10PCR缓冲液5l 10mM dNTP1l 上下游引物10pmol/l2.5l2 CDNA模板5l ddH2O30l Taq酶1l 轻质石蜡油50l100l1. 94 2分钟，55 1分钟，72 2分钟 为第一个步1个循环2. 94 45秒，50 40秒，72 1
8、分钟 为第二步40个循环3. 72 10分钟4. 取出后4 5分钟后-20保存或走电泳四、电泳：约四、电泳：约1.25小时小时1. 配0.5TBE电泳缓冲液300 ml2. 胶浓度1.7%（40ml 0.5TBE加0.68g胶）3. 微波炉中火2分钟溶解胶4. 冷却至60加入溴乙锭2l（10mg/ml的终浓度0.5g/ml）5. 放入梳子，浇板，待凝固6. 加8l PCR反应产物+2l溴酚兰7. 电泳50-80V（每 5V）RACE技技术术目目录录RACE技术-主要分类RACE技术-发展历史RACE技术-引物设计RACE技术-比较与优化RACE技术-实验步骤RACE技术-PCR扩增RACE技术
9、-产物验证RACE技术-克隆和测序RACE技术-cDNA的获得RACE(rapid-amplificationofcDNAends)是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术，通过PCR技术实现的，无须建立cDNA文库，可以在很短的时间内获得有利用价值的信息。RACE是基于PCR技术基础上由已知的一段cDNA片段，通过往两端延伸扩增从而获得完整的3端和5端的方法。RACE技技术术-主要分主要分类类一般分5-和3-RACE两种。3-RACE较简单，首先将mRNA或总RNA用PolyT引物反转录，根据一般基因具有polyA尾巴的特点，选用特异引物(根据已知序列设计)和PolyT引物PCR即可。大多
10、实验者反映一次PCR可以搞定。5-RACE相对较难，目前流行几种5-RACE。其一为加接头(传统)，根据接头引物和自己设计特异引物PCR，可以设计巢式PCR二次扩增。另外，有利用反向PCR技术，连接成环在PCR。还有，GENE公司一种smartRACEPCR，利用反转酶末断加C特点,直接加上多G接头，转换模板而无需用连接酶加接头。RACE技技术术-发发展展历历史史经典的RACE技术是由Frohman等(1988)发明的一项技术，主要通过RT-PCR技术由已知部分cDNA序列来得到完整的cDNA5和3端，包括单边PCR和锚定PCR。该技术提出以来经过不断发展和完善，克服了早期技术步骤多、时间长、
11、特异性差的缺点(Frohman等，1995：Schaefer，l995：Chen，1998：Bespalova等，1998：Matz等1999)。对传统RACE技术的改进主要是引物设计及RT-PCR技术的改进：改进之一是利用锁定引物(lockdockingprimer)合成第一链cDNA,即在oligo(dT)引物的3端引入两个简并的核苷酸【5-Oligo(dT)16_30MN-3,M=A/G/C;N=A/G/C/T】，使引物定位在poly(A)尾的起始点，从而消除了在合成第一条cDNA链时oligo(dT)与poly(A)尾的任何部位的结合所带来的影响；改进之二是在5端加尾时，采用poly(
12、C)，而不是poly(A)；改进之三是采用RNaseH一莫洛尼氏鼠白血病毒(MMLV)反转录酶或选择嗜热DNA聚合酶可能在高温h(60度-70度)有效地逆转录mRNA，从而消除了5端由于高CC含量导致的mRNA二级结构对逆转录的影响；改进之四是采用热启动PCR(hotstartPCR)技术和降落PCR(touchdownPCR)提高PCR反应的特异性。随着RACE技术日益完善，目前己有商业化RACE技术产品推出，如CLONTECH的MarathoTM技术和SMARTTMRACE技术术。邢桂春等(2001)先后使用上述两种试剂盒进行RACE反应，结果发现使用MarathonTM所得到的片断总是比
13、采用SMARTsupTMRACE试剂盒到所得到的片断短。其原因在于MarathonTM技术反转录反应往往不能真正达到mRNA的5末端。所以认为，进行RACE反应应当优选SMARTTMRACE试剂盒。RACE技技术术-引物引物设计设计基因特异性引物（GSPs）应该是：1、2328nt2、5070GC3、Tm值65度，Tm值70度可以获得好的结果需要实验者根据已有的基因序列设计5和3RACE反应的基因特异性引物（GSP1和GSP2).由于两个引物的存在，PCR的产物是特异性的。4、cDNA的合成起始于polyA+RNA。如果使用其它的基因组DNA或总RNA，背景会很高。5、RACEPCR的效率还取
14、决于总的mRNA中目的mRNA的量和不同的引物有不同的退火和延伸温度。6、在进行5和3RACEPCR的时候应该使用热启动。7、重叠引物的设计会对全长的产生有帮助。另外，重叠的引物可以为PCR反应提供一个对照。并不是绝对的要利用设计的引物产生重叠片段。8、引物GSP中的GC含量要在5070之间。这样可以使用降落PCR。避免使用自身互补性的引物序列，否则会产生回折和形成分子内氢键。另外，避免使用与AP1互补的引物，尤其是在3末端。9、如果要用重叠片段来检测设计的引物，GSp1和GSp2之间至少是100200碱基。只有这样才可以用扩增的产物来鉴定设计的引物是否正确。10、降落PCR可以明显的增加RA
15、CEPCR产物的特异性。在最开始的循环中，退火温度高于AP1引物的Tm值，可以增加对特异性条带的扩增。随后的退火和延伸的温度降回到AP1的温度，可以进行随后的PCR循环。11、验证基因特异性引物的对照：单个引物的阴性对照：只用一个引物GSP来进行阴性对照。这样不应该产生任何的条带。如果可以看到明显的产物，应该改变循环的参数，或重新设计原始引物。利用两个GSPS进行阳性对照：（只有两个GSP可以产生重叠的时候才可以采用此步。）为了确定RNA样品中目的基因确实表达，利用两个GSP和接头连接的cDNA来产生阳性对照。可以产生两个引物之间的重叠大小的片段。如果没有这个片段，应该重复cDNA的合成，或者从一个不同的组织或细胞来源进行cDNA的合成。12、制备和抽提polyA+RNA不要使用DEPC处理过的水。纯化完mRNA之后，利用琼脂糖凝胶电泳检测mRNA的质量。哺乳动物的mRNA样品是0.512kb的拖带，在其中有4.5和1.9kb的rRNA的条带。非哺乳动物的mRNA应略小。RACE技技术术-比比较较与与优优化化目的：研究环化法、末端脱氧核糖核酸转移酶法和SMART反转录酶法3种常用5RACE的技术的特点，并对它们进行了优化。方法：以播
