细胞培养及建立泡沫细胞模型

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1、 2)实验手段(1)细胞培养及建立泡沫细胞模型将 THP-1 细胞置于含 10%胎牛血清的 RPMI1640 培养基中，于 370C, 5 CO:培 养箱静置培养。该细胞株属人类单核细胞系，在培养液中呈簇集状悬浮生长，倍增时间 大约在 26 h 后。细胞浓度控制在 106/mL，每两天换液一次，每四天传代一次。细胞复苏 后，传至 3 = 5 代后方可用于建模。(2)建立巨噬细胞模型 取对数生长期的细胞，分为正常组和模型组，调整细胞浓度为 106/mL，接种于 6 孔培 养板，每孔 2 mL。正常组在含 10%胎牛血清的 RPMI 1640 完全培养液中培养。模型 组先 置于含 160 nmol

2、/L PMA 的 RPMI 1640 基础培养液中培养 72 h，贴壁后轻轻吸去上清 液， PBS 洗 3 遍，更换 10%胎牛血清的 RPMI 1640 完全培养液，即得巨噬细胞。巨噬细胞 的鉴 定己在发表文献中完成。(3)建立巨噬源性泡沫细胞模型将获得的巨噬细胞更换含 3%胎牛血清的 RPMI 1640 培养液，并加入终浓度为 80 mg/L 的 Ox-LDL，共同孵育 48 h，油红。染色后，镜下观察细胞内充满橘红色脂滴，即得 泡沫 细胞模型，此过程即为泡沫化。(4)针对 CaSR 的 si RNA 的构建及转染根据公认的 si RNA 设计原则(Nat Biotech 2004; 22

3、: 326-330)设计针对 CaSR 的 3 条 siRNA，选用验证后效果最好的一条。同时合成阳性对照和阴性对照。转染试剂选 用 Invitrogen 公司生产的 LipofectamineTM RNAiMAX Transfection ReagentosiRNA 目标序列的选取原则:工从转录本(mRNA)的 AUG 起始密码开始，寻找AA二连序列，并记下其 3 端的 19 个碱基序列，作为潜在的 siRNA 靶位点。注意:GC 含量在 4_5 070-_5 _5%左右的 siRNA 要比那 些 GC 含量偏高的更为有效;在设计 siRNA 时不要针对_5和 3端的非编码区 Cuntran

4、slated regions UTRs)，原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些 UTR 结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响 siRNP 核酸内切酶复合物结合 mRNA 从而 影响 siRNA 的效果。1)细胞总 RNA 提取:按 Trizol 试剂盒说明书进行，具体操作步骤如下:在细胞 中加入冰预冷的 Trizol 试剂，室温静置_5 min;加 200 1 氯仿，充分摇匀 1_5sec，室 温静 置 2-3 min ; 4 0C，12000rpm 离心 1 _5 min，取上层无色水相层转移至新 EP 管;加等 体积 异丙醇，室温静置 l Omin 4 0C 12000rpm 离

5、心 l Omin，管壁底处可见乳白色沉 淀，即 为 RNA;弃上清，加 7 _5%乙醇 1 ml 4 0C 7_500rpm 离心_5 min，洗涤二次;弃上 层乙 醇，无菌环境风干 RNA 沉淀。用 20 州 DEPC 处理的双蒸馏水(ddH20)溶解 RNA 沉淀，-80 0C 备用;取 4 川总 RNA 加至 200 川灭菌水中，在紫外分光光度仪上测定其 ODZo 和 ODZSo，计算 ODZo/ODZSo。样品总 RNA ug 枢 1) = OD26ox40x 稀释倍数(50 ) /1000 o OD26o /ODZgo 在 1.8-2.0 之间为样品较纯。2)反转录反应:在 20 川

6、反应体积中进行，成分如下:总 RNA tug (5 川)，随机引 物 1 1 DEPC 处理的 ddH20 4.51 70 0C 冰浴 l Omin;加 10 林 1 逆转录反应液(l Oxbuffer 21 MgCL241 dNTP21 inhibitor0.51，逆转录酶 11) 420C 冰浴 60min 99 0C 冰浴_5 min -20 0C 保存备用。3)引物扩增设计:根据 Genebank 序列，设计各个引物序列并合成。4)实时定量 PCR 实验方法:使用宝生物工程(大连)有限公司的 SYRB. Premix Ex TaqTM 和 Light Cycler PCR 扩增仪(Ro

7、che)进行荧光扩增;求出 CT 值。 (6)激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)测定 THP-1 细胞内游离钙的变化取 6 孔板进行 THP-1 细胞培养，事先在 6 孔板中加入盖玻片。取 6 孔培养板中的 盖玻片，D 一 Hanks 液冲洗 2 遍，用 1OOL 的钙离子探针 Fluo-3 /AM 与 F-127 混合工作 液(10 mol/L Fluo-3 /AM, 0.02070 F-127)滴于盖玻片上，370C 避光 40 min D 一 Hanks 液再次冲 洗玻片 3 遍，洗去多余染料，保留少许 D-Hanks 液平衡细胞 10 min，分组施加因素后，于 10 min 内利用 L

8、SCM 进行细胞内 Ca2+浓度检测。 (7)油红 O 染色油红 O 属于偶氮染料，是很强的脂溶剂和染脂剂，与甘油三醋结合呈小脂滴状。 脂 溶性染料能溶于组织和细胞中的脂类，它在脂类中的溶解度比在溶剂中大。当组织切 片 置人染液时，染料则离开染液而溶于组织内的脂质(如脂滴)中，使组织内的脂滴呈橘 红 色。细胞接种于 6 孔培养板内，诱导建模结束后，吸去上清液，用 PBS 洗三次，冰冻 的 4 多聚甲醛固定_5 min， PBS 洗一次，再置于丙二醇中固定_5 min，轻轻吸去丙二醇， 加入 0. _5%油红 O 的丙二醇溶液，置 60烤箱中染色 1 _5 min，用 8_5%丙二醇冲洗_5 m

9、in，再用 PBS 洗三次，蒸馏水清洗 1 次，苏木素复染 2-5 min 1 07oHCL 分色及返蓝后封片。 置显微 镜下观察并摄像，细胞内脂质为红色，胞核为蓝色。参考文献:Zheng XD, Li Q, Tang XB, Liang SJ, Chen LP, Zhang S, Wang ZG, Guo L, Zhang R, Zhu DL. Source of the elevation Ca2+ evoked by I S-HETE in pulmonary arterial myocytes. European Journal of Pharmacology 2008;601:16-

10、22 (8)细胞内胆固醇含量的测定细胞内胆固醇的提取:细胞接种于 6 孔培养板内，培养结束后，吸去上清液，冰预 冷 PBS 洗三次，用细胞刮刀刮取细胞，加 1 mL 冰预冷 0.9%生理盐水重悬细胞，反复冻 融三 次，冰浴中超声破碎_5 min，得细胞裂解液，分装，每份 200 匹，-700C 贮存，用于 测定 总胆固醇和游离胆固醇。总胆固醇的提取:取 160L 上述细胞裂解液，加 300L 15 KOH 乙醇溶液，_50 0C 水 解 2h，加正己烷一异丙醇(4:1)SOOL涡漩 30 s 40C 下 3600 r/min 离心_5 min，取上 层。继 用正己烷一异丙醇(4:1)如上法抽提

11、两次，合并三次抽提的有机相，减压真空干燥，加 20L 内标储备液，用甲醇并定容至 2 mL，摇匀，作为总胆固醇供试品溶液。游离胆固醇的提取:取 160L 上述细胞裂解液，加 300L 乙醇，加正己烷一异丙醇 (4:1)500 匹涡漩 30 s 40C 下 3600 r/min 离心_5 min，取上层。继用正己烷一异丙醇(4:1)如上 法抽提两次，合并三次抽提的有机相，减压真空干燥，加 20L 内标储备溶解并定容 至 2mL，摇匀，作为游离胆固醇供试品溶液。HPLC 测定胆固醇:色谱柱:Hypersil C 18 柱(2.1 mmx150 mm 3m);流动相:甲 醇一水(90:10);流速:

12、0.5 mL/min;柱温:室温;进样量:10 Lo参考文献:唐朝克，王佐，易光辉，万载阳，刘录山，袁中华，王燕，危当 亘，阮长耿，杨永宗.Rolipram 对 THP-1 巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇流出和 ABCA1 表达的影响.中国药理学通报.2003 oct;19(10):1177-82(9) ELISA 法检测细胞因子的分泌情况按每孔 2x1 护个细胞接种于 24 孔板中，含有 160nmo1/L PMA 的培养液培养 72 小时后， PBS 洗三遍，各组加入处理因素，继续培养 24 小时。收集细胞培养上清液。从平衡 至室 温的密封袋中取出实验所需板条，留空白孔。加 O.lml 离心后

13、的细胞培养上清液于反 应 孔中，置 370C 孵育 90 分钟。然后洗板_5 次。(同时做空白孔，标准品空)。于各反应 孔中， 加入新鲜稀释的生物素化抗体工作液 0.1m1 370C 孵育 1 小时，洗板_5 次。加酶结 合工作 液 O.lml 370C 避光孵育 30 分钟，洗板_5 次。加入 O.lml 显色底物液，370C 避光孵 育 1 _5 分钟于各反应孔中加入终卜液 O.lml混匀后即可测量 ODq50 值。 (10)Western Blot 检测蛋白表达变化1)总蛋白的提取:收集细胞，加入冰预冷的蛋白裂解液(lmmol/L PMSF pH7.4) 混匀，超声破碎细胞;4 0C 1

14、2000rpm，离心 1 _5min，取上清液，用考马斯亮蓝法 染色， 测定蛋白含量;取上清加入_5*上样缓冲液(体积比 4: 1) 1000C 沸水中煮_5 min，-20 0C 备用。2 ) SDS-PAGE 电泳:按照胶配置方法配制不同浓度 PAGE 胶，电泳置染料抵达分 离胶底部，断开电源，取下凝胶。切下带有要转移蛋白泳道的凝胶，右下角作一标记 以 确定方向及正反而。3)转膜:剪 1 块与凝胶大小相同的 NC 膜(不能大于凝胶)，右下角作一标记，浸 泡于转移缓冲液中，大约_5 min o 剪 8 块滤纸，右下角作一标记，其大小略与凝胶相 同(不能大于凝胶)。将剪好的滤纸在转移缓冲液中浸

15、泡，按阳极到阴极(从下至上)川页 序安装转移装置:平放底部电极，在底部电极上放置 4 张浸泡好的滤纸，精确对齐，将 NC 膜放在滤纸上，排除气泡。把 SDS-PAGE 电泳凝胶转移到去转移缓冲液中漂洗， 平 放于 NC 膜上，用玻棒挤出所有气泡，在其上再放置 4 张浸泡好的滤纸，排出气泡。 将 上层电极放于夹层物上，连接电源，根据凝胶而积按 1 mA/cm2 接通电源。4)封 17:转移结束后，在 TBS-T 液内清洗 20min，加_5%脱脂奶粉，37 0C 封闭lho_5)一抗孵育:封闭结束后，用 TBS-T 稀释第一抗体，将 NC 滤膜置于其中，4 0C 震荡过夜。6)显迹:TBS-T

16、液漂洗 NC 膜 3 次/l Omin，将膜与 TBS-T 稀释二抗孵育，室温下 振荡 1h; TBS-T 漂洗 NC 膜 3 次/lOmin; TBS 液漂 NC 膜 3 次/l Omin X 光胶片 上曝光， 随后显影、定影，用图像分析系统测定蛋白条带的光密度，进行定量分析。(11)免疫荧光技术检测蛋白表达定位1)细胞生长贴在玻片上，细胞密度适中，大约 60-7_5%满片即可。2)取出细胞后用 4%多聚甲醛固定 1 _5 分钟，现用现配。3) PBS 冲洗。4) 0.107oTriton 作用 20 分钟。5) PBS 冲洗。6) 10%正常血清封闭 10 分钟。: 7)加入一抗，4 度孵育过夜。 8) PBS 冲洗 4 次，各_5 分钟。 9)加入荧光二抗，室温 30 分钟。 10) PBS 冲洗 4 次，各_5 分钟。 11) 90%甘油封片。 12)避光保存，荧光显