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1、高高压压液相色液相色谱谱(HPLC)基本概念和理基本概念和理论论一、基本概念和一、基本概念和术语术语1.色色谱图谱图和峰参数和峰参数色色谱图谱图(chromatogram)-样样品流品流经经色色谱谱柱和柱和检测检测器，器，所得到的信号所得到的信号-时间时间曲曲线线，又称色，又称色谱谱流出曲流出曲线线(elution profile)。 。基基线线(base line)-经经流流动动相冲洗，柱与流相冲洗，柱与流动动相达到平相达到平衡后，衡后，检测检测器器测测出一段出一段时间时间的流出曲的流出曲线线。一般。一般应应平行平行于于时间轴时间轴。 。噪音噪音(noise)-基基线线信号的波信号的波动动。
2、通常因。通常因电电源接触不源接触不良或瞬良或瞬时过载时过载、 、检测检测器不器不稳稳定、流定、流动动相含有气泡或色相含有气泡或色谱谱柱被柱被污污染所致。染所致。漂移漂移(drift)-基基线线随随时间时间的的缓缓变缓缓变化。主要由于操化。主要由于操作条件如作条件如电压电压、温度、流、温度、流动动相及流量的不相及流量的不稳稳定所引起，定所引起，柱内的柱内的污污染物或固定相不断被洗脱下来也会染物或固定相不断被洗脱下来也会产产生漂移。生漂移。色色谱谱峰峰(peak)-组组分流分流经检测经检测器器时时响响应应的的连续连续信号信号产产生的曲生的曲线线。流出曲。流出曲线线上的突起部分。正常色上的突起部分。
3、正常色谱谱峰近峰近似于似于对对称形正称形正态态分布曲分布曲线线（高斯（高斯 Gauss 曲曲线线）。不）。不对对称称色色谱谱峰有两种：前延峰峰有两种：前延峰(leading peak)和拖尾峰和拖尾峰(tailing peak)。前者少。前者少见见。 。拖尾因子拖尾因子(tailing factor， ，T)，用以衡量色，用以衡量色谱谱峰的峰的对对称性。也称称性。也称为对为对称因子称因子(symmetry factor)或不或不对对称因称因子子(asymmetry factor)。 。 中国中国药药典典 规规定定 T 应为应为0.951.05。 。T0.95 为为前延峰，前延峰，T1.05 为
4、为拖尾峰。拖尾峰。峰底峰底-基基线线上峰的起点至上峰的起点至终终点的距离。点的距离。峰高峰高(peak height， ，h)-峰的最高点至峰底的距离。峰的最高点至峰底的距离。峰峰宽宽（ （peak width， ，W)-峰两峰两侧侧拐点拐点处处所作两条切所作两条切线线与基与基线线的两个交点的两个交点间间的距离。的距离。W4半峰半峰宽宽（ （peak width at half-height， ，Wh/2)-峰高一峰高一半半处处的峰的峰宽宽。 。Wh/22.355标标准偏差（准偏差（standard deviation， ，)-正正态态分布曲分布曲线线x1 时时（拐点）的峰（拐点）的峰宽宽之半
5、。正常峰的拐点在峰高的之半。正常峰的拐点在峰高的0.607 倍倍处处。 。标标准偏差的大小准偏差的大小说说明明组组分在流出色分在流出色谱谱柱柱过过程中的分散程度。程中的分散程度。 小，分散程度小、极点小，分散程度小、极点浓浓度高、度高、峰形瘦、柱效高；反之，峰形瘦、柱效高；反之， 大，峰形胖、柱效低。大，峰形胖、柱效低。峰面峰面积积(peak area， ，A)-峰与峰底所包峰与峰底所包围围的面的面积积。 。2.定性参数（保留定性参数（保留值值） ）死死时间时间(dead time， ，t0)-不保留不保留组组分的保留分的保留时间时间。即。即流流动动相（溶相（溶剂剂）通）通过过色色谱谱柱的柱的
6、时间时间。在反相。在反相 HPLC 中可中可用苯磺酸用苯磺酸钠钠来来测测定死定死时间时间。 。死体死体积积(dead volume， ，V0)-由由进样进样器器进样进样口到口到检测检测器流器流动动池未被固定相所占据的空池未被固定相所占据的空间间。它包括。它包括 4 部分：部分：进样进样器至色器至色谱谱柱管路体柱管路体积积、柱内固定相、柱内固定相颗颗粒粒间间隙（被隙（被流流动动相占据，相占据，Vm）、柱出口管路体）、柱出口管路体积积、 、检测检测器流器流动动池体池体积积。其中只有。其中只有 Vm 参与色参与色谱谱平衡平衡过过程，其它程，其它 3 部分只部分只起峰起峰扩扩展作用。展作用。为为防止峰
7、防止峰扩扩展，展，这这 3 部分体部分体积应积应尽量尽量减小。减小。V0Ft0（ （F 为为流速）流速）保留保留时间时间(retention time， ，tR)-从从进样进样开始到某个开始到某个组组分在柱后出分在柱后出现浓现浓度极大度极大值值的的时间时间。 。保留体保留体积积(retention volume， ，VR)-从从进样进样开始到某开始到某组组分在柱后出分在柱后出现浓现浓度极大度极大值时值时流出溶流出溶剂剂的体的体积积。又称。又称洗脱体洗脱体积积。 。VRFtR调调整保留整保留时间时间(adjusted retention time， ，tR)-扣除扣除死死时间时间后的保留后的保留
8、时间时间。也称折合保留。也称折合保留时间时间(reduced retention time)。在。在实验实验条件（温度、固定相等）一定条件（温度、固定相等）一定时时， ，tR 只决定于只决定于组组分的性分的性质质，因此，因此，tR（或（或 tR）可用于定）可用于定性。性。tRtRt0调调整保留体整保留体积积(adjusted retention volume， ，VR)-扣除死体扣除死体积积后的保留体后的保留体积积。 。3.柱效参数柱效参数理理论论塔板数塔板数(theoretical plate number， ，N)-用于定用于定量表示色量表示色谱谱柱的分离效率（柱的分离效率（简简称柱效）。
9、称柱效）。N 取决于固定相的种取决于固定相的种类类、性、性质质（粒度、粒径分布等）、（粒度、粒径分布等）、填充状况、柱填充状况、柱长长、流、流动动相的种相的种类类和流速及和流速及测测定柱效所定柱效所用物用物质质的性的性质质。在一。在一张张多多组组分色分色谱图谱图上，如果各上，如果各组组分分含量相当，含量相当，则则后洗脱的峰比前面的峰要逐后洗脱的峰比前面的峰要逐渐渐加加宽宽，峰，峰高高则则逐逐渐渐降低。降低。用半峰用半峰宽计宽计算理算理论论塔数比用峰塔数比用峰宽计宽计算更算更为为方便和方便和常用，因常用，因为为半峰半峰宽宽更易准确更易准确测测定，尤其是定，尤其是对对稍有拖尾稍有拖尾的峰。的峰。N
10、 与柱与柱长长成正比，柱越成正比，柱越长长， ，N 越大。用越大。用 N 表示柱效表示柱效时应时应注明柱注明柱长长，如果未注明，如果未注明，则则表示柱表示柱长为长为 1 米米时时的的理理论论塔板数。（一般塔板数。（一般 HPLC 柱的柱的 N 在在 1000 以上。）以上。）若用若用调调整保留整保留时间时间(tR)计计算理算理论论塔板数，所得塔板数，所得值值称称为为有效理有效理论论塔板数塔板数(N 有效或有效或 Neff)。 。理理论论塔板高度塔板高度(theoretical plate height， ，H)-每每单单位位柱柱长长的方差。的方差。实际应实际应用用时时往往用柱往往用柱长长 L
11、和理和理论论塔板数塔板数计计算。算。4.相平衡参数相平衡参数分配系数分配系数(distribution coefficient， ，K)-在一定温度在一定温度下，化合物在两相下，化合物在两相间间达到分配平衡达到分配平衡时时，在固定相与流，在固定相与流动动相中的相中的浓浓度之比。度之比。分配系数与分配系数与组组分、流分、流动动相和固定相的相和固定相的热热力学性力学性质质有有关，也与温度、关，也与温度、压压力有关。在不同的色力有关。在不同的色谱谱分离机制中，分离机制中，K 有不同的概念：吸附色有不同的概念：吸附色谱谱法法为为吸附系数，离子交吸附系数，离子交换换色色谱谱法法为选择为选择性系数性系数(
12、或称交或称交换换系数系数)，凝胶色，凝胶色谱谱法法为为渗透参数。但一般情况可用分配系数来表示。渗透参数。但一般情况可用分配系数来表示。在条件在条件(流流动动相、固定相、温度和相、固定相、温度和压压力等力等)一定，一定，样样品品浓浓度很低度很低时时(Cs、 、Cm 很小很小)时时， ，K 只取决于只取决于组组分的性分的性质质， ，而与而与浓浓度无关。度无关。这这只是理想状只是理想状态态下的色下的色谱谱条件，在条件，在这这种条件下，得到的色种条件下，得到的色谱谱峰峰为为正常峰；在正常峰；在许许多情况下，随多情况下，随着着浓浓度的增大，度的增大，K 减小，减小，这时这时色色谱谱峰峰为为拖尾峰；而有拖
13、尾峰；而有时时随着溶随着溶质浓质浓度增大，度增大，K 也增大，也增大，这时这时色色谱谱峰峰为为前延峰。前延峰。因此，只有尽可能减少因此，只有尽可能减少进样进样量，使量，使组组分在柱内分在柱内浓浓度降度降低，低，K 恒定恒定时时，才能，才能获获得正常峰。得正常峰。在同一色在同一色谱谱条件下，条件下，样样品中品中 K 值值大的大的组组分在固定分在固定相中滞留相中滞留时间长时间长，后流出色，后流出色谱谱柱；柱；K 值值小的小的组组分分则则滞滞留留时间时间短，先流出色短，先流出色谱谱柱。混合物中各柱。混合物中各组组分的分配系分的分配系数相差越大，越容易分离，因此混合物中各数相差越大，越容易分离，因此混
14、合物中各组组分的分分的分配系数不同是色配系数不同是色谱谱分离的前提。分离的前提。在在 HPLC 中，固定相确定后，中，固定相确定后，K 主要受流主要受流动动相的性相的性质质影响。影响。实实践中主要靠践中主要靠调调整流整流动动相的相的组组成配比及成配比及 pH值值，以，以获获得得组组分分间间的分配系数差异及适宜的保留的分配系数差异及适宜的保留时间时间， ，达到分离的目的。达到分离的目的。容量因子容量因子(capacity factor， ，k)-化合物在两相化合物在两相间间达达到分配平衡到分配平衡时时，在固定相与流，在固定相与流动动相中的量之比。因此相中的量之比。因此容量因子也称容量因子也称质质
15、量分配系数。量分配系数。容量因子的物理意容量因子的物理意义义：表示一个：表示一个组组分在固定相中停分在固定相中停留的留的时间时间（ （tR）是不保留）是不保留组组分保留分保留时间时间（ （t0）的几倍。）的几倍。k0 时时，化合物全部存在于流，化合物全部存在于流动动相中，在固定相中不相中，在固定相中不保留，保留，tR0； ；k 越大，越大，说说明固定相明固定相对对此此组组分的容量越分的容量越大，出柱慢，保留大，出柱慢，保留时间时间越越长长。 。容量因子与分配系数的不同点是：容量因子与分配系数的不同点是：K 取决于取决于组组分、分、流流动动相、固定相的性相、固定相的性质质及温度，而与体及温度，而
16、与体积积 Vs、 、Vm 无无关；关；k 除了与性除了与性质质及温度有关外，及温度有关外，还还与与 Vs、 、Vm 有关。有关。由于由于 tR、 、t0 较较 Vs、 、Vm 易于易于测测定，所以容量因子比分定，所以容量因子比分配系数配系数应应用更广泛。用更广泛。选择选择性因子性因子(selectivity factor， ，)-相相邻邻两两组组分的分分的分配系数或容量因子之比。配系数或容量因子之比。 又称又称为为相相对对保留保留时间时间（ （ 美美国国药药典典 ）。）。要使两要使两组组分得到分离，必分得到分离，必须须使使 1。 。 与化合物在与化合物在固定相和流固定相和流动动相中的分配性相中的分配性质质、柱温有关，与柱尺寸、柱温有关，与柱尺寸、流速、填充情况无关。从本流速、填充情况无关。从本质质上来上来说说， ， 的大小表示两的大小表示两组组分在两相分在两相间间的平衡分配的平衡分配热热力学性力学性质质的差异，即分子的差异，即分子间间相互作用
