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1、1.克隆到 shRNA 表达载体中的 shRNA 包括两个短反向重复序列，中间由一茎环（loop）序 列分隔的，组成发夹结构，由 pol启动子控制。随后在连上 5-6 个 T 作为 RNA 聚合酶 的转录终止子。 2.两个互补的寡核苷酸两端须带有限制性酶切位点(是切开之后的酶切位点残基)。 3.Stratagene 发现 29 个寡核苷酸较之原先推荐的 23 个寡核苷酸可以更有效的抑制目的基因。4.在启动子下游的酶切位点下方紧连一个 C， （有时会连 2 个 CC）使插入片段和启动子有一 定空间间隔以确保转录的发生。 5.ShRNA 目的序列的第一个碱基必须是 G 以确保 RNA 聚合酶转录。
2、如果选择的目的序列 不以 G 开头，必须在紧连正义链的上游加一个 G。 6.ShRNA 插入片段中的茎环应当靠近寡核苷酸的中央。不同大小和核苷酸序列的茎环都被 成功的运用过。其中包含一个独特的限制性酶切位点的茎环利于检测带有 shRNA 插入片段 的克隆。在比较了众多不同长度和序列的茎环，5TCAAGAG3序列最为有效。 7.5-6 个 T 必须放置在 shRNA 插入片段尾部以确保 RNA 聚合酶 III 终止转录。 8.在正义链和反义链序列上不能出现连续 3 个或以上的 T。这可能导致 shRNA 转录的提前 终止。靶 siRNAA 序列选择是 RNAi 实验成败的关键。哺乳动物细胞 RN
3、Ai 实验中，使用最广泛且最有效的是21bp siRNA。siRNA 由正义链和反义链组成，两条链 3端均有端均有 2 个碱基突出，一般为个碱基突出，一般为 UU 或或 dTdT，其中正义链的前正义链的前 19nt 与靶基因序列相同。与靶基因序列相同。1. siRNA 设计的原则 SiRNA 双链设计时，一般在靶 mRNA 起始密码下游 100200bp 至翻译终止密码上游 d0 100bp 的范围内搜寻 AA 序列，并记录每个 AA3端相邻 19 个核苷酸作为候选 si.RNA 靶位点。 其中 AA（N19）TT 是最理想的序列，若靶 mRNA 中无此序列，亦可选用 NA（N21）或 NAR
4、（N17）YNN（R 表示嘌呤，Y 表示嘧啶） ，但在合成时，siRNA 的正义链 3端需用 dTdT 代替。TuscRl 等建议设计的 siRNA 不要针对 mRNA 的 5和 3端非编码区，因为这些区域 有丰富的调控蛋白结合位点，而 UTR 结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响 siRNP（siRNA protein complex，核酸内切酶复合物）结合 mRNA，从而影响 siRNA 干扰的效 果。最后还应将候选 siRNA 序列在 GenBank 进行 BLAST 检索，与非同源基因具有 3 个或 3 个以上碱基相异的序列方可选用。高效高效 siRNAsiRNA 的序列结构特征的序列
5、结构特征除了靶序列位点的选择，siIRNA 序列本身结构特征亦会影响到 RNAi 效率。RNAi 实质上可视为一个RNA 与蛋白质互作过程，包括 siRNA 与 RISC 结合、RISC 的激活以及 RISC 与靶 mRNA 的结合和切割，这种互作效应的存在，往往造成 siRNA 链的选择具有偏爱性。Reynolds 等通过对 2 个基因的 180 条siRNA 序列分析，归纳出以下 8 个与siRNA 高效性相关的特征:G/C 含量低(30%-52%)，正义链 3端具较低稳定性（有利于 siRNA 与 RISC的结合和解链），无反向重复序列（有利于减小 siRNA 的有效作用浓度，提高 si
6、RNA 干扰效率），正义链碱基的偏爱性 A19（正义链中第 19 位碱基为 A，如下表示类同）；A3；U10；无 G/C(正义链中第 19 位碱基不为 G 或 C)；无 G13。依此规则，Reynolds 等设计的 30 条 siRNA 中有 29 条是有效的。Kumiko 等亦认为 siRNA 反义链 5端为 A/U（即有义链 U/A）19 和最后 7 个碱基中有 5 个 A/U，会有助于 RNAi 的高效发挥，且正义链 G/C1 和序列中无连续 9nt 以上的 GC 重复片段与基因沉默效率呈显著相关。有趣的是，该实验还表明这些规则同样适用于 DNA 介导的 RNAi（DNA-based R
7、NAi.）实验。此外，Amarzguioui 等发现正义链 5与 3端的前 3 个碱基中 A/U 含量不对称(3端含量应高一些)和 A6 对 siRNA 的活性亦影响很大。根据上述结果，可以初步绘制出一个高效 siRNA 序列结构的精细与简略示意图。现已知道 siRNA 的反义链决定着靶位点识别，那么在不影响 siRNA 作用功效的前提下，是否可以对其正义链碱基作适当更改或修饰呢？Amarzguioui 等研究 siRNA 不同部位对碱基突变和化学修饰的耐受性，认为 siRNA 的 5端相对于 3端具有对突变的较高耐受性。有学者认为正义链 3突出端的任何碱基修饰对 siRNA 作用效果均无明显影响。还有学者认为与反义链互补的正义链 3端发生14 个碱基的错配反而有助于增强 RNAI 的活性。
