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1、ELISA 测定技术的发展和质量控制ELISAELISA 测定技术的发展和质量控制测定技术的发展和质量控制ELISA 试验是一种敏感性高，特异性强，重复性好的实验诊断方法。由于其试剂稳定、易保存，操作简便，结果判断较客观等因素，已广泛应用在免疫学检验的各领域中。然而，影响 ELISA试验结果的因素很多，故加强各个环节的质量保证才能充分发挥其方法学的优点。一、ELISA 试剂盒测定技术的发展临床测定技术的发展主要在于方法学的发展，而方法学的发展依托于试剂生产技术不断进步更新和型标记物的应用。目前，分子生物学正在并最终肯定会让我们对整个生命科学有一个全面而彻底的认识，其对免疫测定技术发展的影响也是
2、直接而又有效的，它使我们对以前一些难以检测的生物活性物质的测定变得轻而易举，并且大大提高了检测的灵敏度和特异性。1、基因工程试剂对免疫测定技术 发展的影响免疫测定技术的基础在于抗原抗体之间的特异结合反应，所以任何优质的诊断试剂离不开优质的原料，如抗原抗体，酶等。以前用于免疫测定的抗原通常为各种纯化抗原，而抗体则为纯化抗原免疫动物后获得的多克隆抗体和使用杂交瘤技术得到的单克隆抗体，而抗原或抗体的标记物如酶标结合物则通过各总化学合成方法制备。近年来，随着分子生物学的发展，使用基因工程方法制备各种特殊的抗原或抗体及其酶结合物等免疫测定试剂几成为现实的新一代试剂，各种新型使用的测定方法也不断出现。HB
3、sAg 试剂特点（检测模式：临 床抗体夹心法）：包被抗体为山羊多抗，多抗具有高亲和性和对抗原各种表位的反应性。酶表抗体为与 HBsAg 有不同结合位点的鼠复合单位。可测得 HBsAg 变异样品。提高检测的特异性（99.98%）提高检测的灵敏度，应用 Parl Ehrich 学说（PEI）HBsAg 标准品，对 ad 标准品的灵敏度为0.05n/ml 对 ay 标准品灵敏度为 0.025ng/ml2、基因工程较早用于免疫测定的基因工程抗原是 HBcAg 和 HBsAg,这两种基因工程抗原的出现，较好地解决了抗 HBc 和 HBe 的测定问题。因为要从病毒本身去大量获取这两种纯抗原较为困难，并且这
4、一点对于难培养的病原微生物来说，如 HIV、HCV 和梅毒螺旋体等都有些共性。2.1 HCV-ELISA 试剂HCV 目前尚不能体外培养，只能用基因工程或化学合成方法获取 HCV 结构和非结构区的各种抗原片断，已知 HCV 基因组有 7 个功能区组成：核心、E1、E2/NS1 NS2 NS3 NS4 NS5(有分为NS5a 和 NS5b)区，合成抗原的优点是易于纯化，特异性好，抗原抗体反应强。2.1.1 第一代抗 HCV-ELISA 试剂盒：-由美国 ortho 公司克隆 C1003 抗原几个片断与人超氧化物歧化酶（SOD）结合。用酵母从病毒基因组非结合区得到表达，表达为融合蛋白，亦作为包被固
5、相载体。-抗原组合：NS4 区二个基因片断为 NS 5-1-1 和 C1003-特性：IgG 抗 C100 在发病后数月后，才检出，故不宜作早期诊断。-约由 20%的病人不出现抗体。IgM 抗-C100 急性期检出率只有 64%。-C100 的抗原性较弱，在 HCV 复制中，不能充分暴露宿主的免疫系统。-特异性和灵敏性较差。2.1.2 第二代 HCV-ELISA 试剂盒-用基因重组的 HCV 结构蛋白与非结构蛋白抗原包被固相载体。-抗原组合：核心区（C 区）多肽 C22 NS 区多肽 C33 C1003 和 NS 5-1-1-增加 C22 区和 C33 区后，抗体出现早，有助早期诊断，提高阳性
6、率。有利早期诊断。-C22 是早期易出现病毒血症2.1.3 第三代 HCV-ELISA 试剂盒人工合成多肽抗原，由 36 个氨基酸组成的 Cp9(内壳蛋白)和 19 个氨基酸组成 Cp10 混合包被固相载体。抗原组合：除有 C 100-3 C22 C33 外又增加了 core 和 NS3 NS4 NS5特点：*core NS3 NS5 由 Baculovirus 重组表达，没有非特异性的 载体，试剂特异性高 ，重组的蛋白经融合形成大分子抗原，利于提高检测灵敏度。* NS3 区增加了氨基酸片断（比例十分重要）。改进了反映的灵敏度。* NS5 经优化，徐去了非特异性的区域（G-D-D）NS3 NS
7、5 是血转化最早测得的抗体，提高了诊断的准确性。* NS4 为俩个片断的合成多肽，去掉了非特异性反应的区域，加强了试剂的灵敏度和特异性。2.1.4 第四代 HCVELISA 试剂盒-美国新近推出一种包括 HCV 基因组 7 个功能区所有免疫决定基的单一融合蛋白，称为多决定基融合抗原，采用表面活性剂处理分界病毒表面复合物，释放 HCV 核心抗原（core）并用 ELISA法，灵敏度可达 500 拷贝/ml，已接近核酸扩增检测水平。-抗原组合：以 Core 和 NS3 作为主要检测片断（比例十分重要）加合成多肽 NS4-特点：直接测 Core 抗原不易发生变异抗 IgM 和 IgG 检出率可达 1
8、00%特异性达 99.8%灵敏度为 100%3、基因工程抗体及其功能试剂80 年代后人们开始使用基因工程技术制备抗体，并进而将抗体分子片断与其它蛋白（或另一种抗体分子）融合得到多功能试剂，到目前为止，基因工程抗体在免疫测定上的应用尚处于一个初级阶段。且主要是将抗体与其它蛋白以融合蛋白形式表达而得到多功能试剂，如澳大利亚学者应用基因工程技术制备了抗人红细胞抗体与 HIV-1gpN41 的融合蛋白。这种重组蛋白，即基因工程双功能试剂，在此基础上，建立了快速，灵敏和特异的自身红细胞凝集试验（AGEN）.3.1 HIV-ELISA 抗原/抗体试剂1998 年,美国首先研制第四代试剂,对检测 HIV 的
9、同时检测 P24(核心)抗原,故称 HIV 抗原/抗体试剂,国内已有引进.抗原组成:gp160gp36gp170 和单克隆抗 p24 抗体包被.3.1.2 P24 抗原测定采用夹心法 ELISA,即将将纯化的已知抗体包被，当加入带测血清后，若血清中含有 P24 与包被抗体形成抗原抗体复合物，再加入酶（HRP）标记 HIV 抗体。在抗原上又结合了酶标记的抗体，加底物 显色后在酶标仪上读结果。近来为提高检测血清中 P24 抗原的敏感性，将血清中免疫复合物（ICD)解离后再进行测定。发展了（ICD) P24 抗原测定技术。3.1.3 抗 HIV-ELISA 试剂目前对 HIV 的检测原料有了较大改进
10、，主要如下：（1）可用于检测血清或血浆中 HIV IgM 亚特异性抗体和检测 HIV-1、2 和多种亚型。（2）标记的抗原：a.含 HIV-1B 亚型 gp41 和 P24 的 HIV-1 重组融合蛋白。b.可特异性检测血清或血浆中 HIV M 群的抗体，绝大多数 HIV-1.0 群和 HIV-2 群的抗体。c.gp36 免疫调控区的 HIV-2 多肽可测定特异性的 HIV-2 抗体。d.gp41 的俩段 HIV 1.0 群多肽，可测特异性 HIV 1.0 群的抗体 和 HIV 1M 群的抗体。从以上抗原设计保证 HIV 的来自不同亚型/或区域的抗原亚型抗体的检测。减少了变异株的漏检。HIV-
11、1.0.2 对 759 份各类临床样品包括 401 份 HIV-1 感染不同阶段病人样品，204 分 HIV-2 感染不同阶段病人样品，和 154 份与 HIV 无关的其他疾病患者的样品的检测结果。特异性：99.93% 灵敏度：100%对欧洲血液中心的 8842 份常规鲜血者样品用 HIV-1.0.2 进行评价筛选，并经确认实验获得的结果。3.1.4 HIV 确认试剂免疫印记（WB 或 RIBA）试剂判断标准我国 HIV 抗体阳性：至少二条膜带（即 gp160/gp120）或至少一条膜带和 p24(核心)带同时出现美国 HIV-1 阳性（任何两个中有二条带（P24 gp41 gp120/gp1
12、60）, HIV-2 无阳性WHO : HIV -1 阳性（不管有无核心带或酶带， 但有两条膜带）HIV-2 阳性（不管有无核心带或酶带，单有两条膜带即为阳性）4、 基因工程酶及其融合蛋白除了基因工程抗原、抗体外，与标记免疫测定有关的另一中重要的基因工程试剂就是酶及其融合蛋白，以重组酶建立免疫测定方法较为成功的是 CEDIATM 均相酶免疫试验。使用基因工程酶技术生产免疫测定标记酶，是得到符合标记要求的高纯度酶的一条新途径，但如以其他蛋白（抗原或抗体）融合的方法，不但避免了繁琐且低效率的酶与蛋白的化学交联，而且无需得到纯化的酶和抗原或抗体。随着分子生物学技术的发展，将有越来越多的酶免疫测定方法
13、建立在基因工程酶或其融合蛋白的基础之上。发展趋势如下：1）、由单一病原蛋白向多决定簇融合蛋白转变，并尽可能包括病原体基因组功能区的所有的能引起肌体免疫应答的决定簇。2）、表达的抗原将尽可能少含有非特异性抗原 或共同抗原。3）、为某一目的如病原体基因型确定而设计表达特定的多肽抗原片断。总之，将围绕改善免疫测定的特异性和敏感性来制备基因工程片断。二、 试剂盒的方法学设计目前，ELISA 的测定模式，主要有双抗体夹心法测定抗原，如 HBsAg,HBeAg,AFP,HCG 等；间接法测定抗体如 HCV ,抗 HIV 等；双抗体夹心法测抗体如 HBs，竞争法测抗体，如 HBe,抗 HBc 等；竞争法测抗
14、原，如激素等小分子。固相捕获法测 IgM 抗体等，这里只简述双抗夹心法测抗原。目前有一步法和二步法之分。1、HBsAg-ELISA 法：?1.1 一步法：在加入待测物的同时加入酶结合物一起温育，一步即完成反应过程，一步法ELISA 的反应曲线为钟型曲线(见图 1)，也就是说测定随着待测物中抗原浓度的增加而升高至一定后，测定吸光度即随抗原浓度的增加而开始下降直至不显色，即所谓的“钩状效应”(HOOK effect)，也就是我们在免疫沉淀实验中所称的“带现象”。一步法的反应平衡式如下：?Ab+Ag+Ab*AbAgAb*+AbAg+AgAb*+Ab*AgAb*?(a) (b) (c) (d)? 其中
15、 a 为最后测定结果的显色源，当待测物中 Ag 浓度增加时，无疑会使 b,c,和 d 复合物增加，从而消耗有限的 Ab*,使 a 复合物相应减少，显色降低，吸光度对抗原浓度的变化曲线成钟型曲线，而且由于 d 复合物的形成，使得在同样的 Ab*浓度下，一步显色较二步法为浅。?目前一步法所出现“钩状效应”，现已有进展，即采用包被为一种抗体，酶标记用空间距离较远的决定簇的抗体，同时在操作中充分混匀反应液，并适当延长温育时间，则可使 b,c 和 d 复合物减少到最低程度，而不出现“钩状效应”图 1 一步法 ELISA 抗原浓度与显色变化的反映曲线二步法：随着待测物中抗原浓度的逐步增加，将使固相抗体与抗
16、原的结合逐步达到饱和(见 1 式)，这样在一定浓度 Ab*的存在下，AbAg 复合物的形成将直接与 Ab*结合(见 2 式)，抗原浓度的逐步增加导致了显色的逐步加深，而形成 S 形变化曲线(见下图 2)：?Ab+AgAbAg (1)AbAg+Ab*AbAgAb* (2) 综上所述，一步法 ELISA 试剂盒作为适合临床实验室简便快速要求的产物，有着巨大市场，其虽有潜在缺陷，易导致高浓度待测物的标本检测为假阴性，但精心的实验设计，对包被和酶标记抗体的仔细选择，完全可以将“钩状效应”出现的可能性降至最低。图 2 二步法 ELISA 抗原浓度与显色变化的反映曲线灰区概念：合并二种方法一步法试剂其反应平衡点为图中反应曲线 A 点,处在抗原抗体反应的上坡图中，故受反映条件的改变而影响 A 值二步法抗原抗体反应已达反应的平台期从图见一步法 A 点则受反应条件的改变而影响 A 值。因此出现Al(可能是假阳性)，A2(可能是假阴性)。因此
