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1、1人宫颈癌 FHIT 基因的表达改变与 HPV16 感染的关系【摘要】 目的 探讨 FHIT 基因表达改变和 HPV16 感染与人宫颈癌发生的关系。方法 采用反转录-巢式聚合酶链反应方法测定 5 种人宫颈癌细胞株(SiHa、HeLa、RJC-1、CS1213、C4-1)和 58 例宫颈癌组织与 18 例正常宫颈对照中FHIT mRNA 的表达；回收 7 例 FHIT 基因不同的转录扩增产物，纯化后进行 DNA测序；PCR 技术检测组织中 HPV16 型的感染状况。结果 SiHa、HeLa 和 C4-1 宫颈癌细胞中有 FHIT 基因转录异常; 宫颈癌组织中 39 例(67.2%)存在 FHIT
2、 基因异常表达，显著高于正常对照组 0 例(0%)(P0.05)；37 例(63.8%)有 HPV16 感染，显著高于正常对照组 1 例(5.0%)(P0.05)。宫颈癌组织中有 HPV16 感染患者的FHIT 基因表达异常数(30/37)显著高于 HPV16 未感染的患者(9/21)，二者之间存在相关性(P0.01)；FHIT 基因的异常表达和 HPV16 的感染与患者的年龄、临床分期、肿瘤直径、病理分级及是否伴淋巴结转移无相关性(P0.05)。序列分析发现 FHIT 基因转录本主要存在不同程度的外显子的缺失，以第 5 位和第 6 位外显子的缺失为主，未见未知序列的插入和点突变。结论 FHI
3、T 基因在人宫颈癌组织中的异常表达率明显增高，且与 HPV16 的感染有关，这些改变可能在人宫颈鳞癌的发生中起着重要作用。 【关键词】 宫颈癌；FHIT 基因；基因缺失；人乳头瘤病毒(HPV)ABSTRACT: Objective To evaluate the relationship between fragile histidine triad (FHIT) transcription abnormalities and HPV16 infection and human cervical tumorigenesis. Methods Total RNA from 5 cervical
4、carcinoma cell lines (SiHa, HeLa, RJC-1, CS1213 and C4-1), 58 primary cervical cancer specimens and 18 normal cervical epithelial tissues were extracted and FHIT transcripts were characterized by a 2two-step(nested) reverse transcription (RT)-PCR. The seven of the PCR products with different size we
5、re purified and sequenced. HPV16 infection was assessed by PCR. Results There were altered FHIT transcripts in SiHa, HeLa and C4-1 cells. Aberrant FHIT transcripts were detected in 39 out of the 58 cervical cancer samples (67.2%), but none out of 18 in the normal cervix tissue specimens (0%); HPV16
6、infections were identified in 37 of the 58 cervical cancer tissues (63.8%), but 1 in the 18 normal cervical epithelial tissues (5%), which showed a significant difference between these two groups (P0.05). The number of partial deletions of the FHIT gene in the group with HPV16 infection (29/37) was
7、significantly higher than that in the group without HPV16 infection (9/21) and the correlation was found between aberration of FHIT transcript and HPV16 infection. There was no obvious difference in age, stage, tumor size, grade and lymph node metastasis between the groups with and without FHIT abno
8、rmalities and HPV16 infection (P0.05). The exon 5 and exon 6 were mainly deleted in the altered FHIT transcripts and no insertion and point mutation were found by DNA sequencing. Conclusion Aberrant FHIT expression was significantly common in cervical cancers and was correlated with HPV16 infection.
9、 These findings suggest that the tumor suppressor gene FHIT and high risk HPV16 may play a very important role in human cervical carcinogenesis.KEY WORDS: cervical cancer; fragile histidine triad (FHIT); deletion; human papillomavirus 16 (HPV16)子宫颈癌是世界范围内女性第二位常见的恶性肿瘤，每年死亡人数超过 27 万1。研究表明子宫颈癌的发生与高危型 H
10、PV 感染和宫颈组织内众多基因表达改变有关，包括 HPV16 和定位于染色体 3p14.2 的脆性组氨酸三联体(fragile histidine triad, FHIT)基因等2-3。由于 FHIT 基因区域覆盖 3p 上的 HPV16 的整合位点，两者在子宫颈癌发生中的作用及其相互关系值得探讨4。本研究采用RT-PCR 方法在宫颈鳞癌中检测 FHIT 基因的转录表达，并同时检测 HPV16 的感染情况，现将结果报道如下。1 材料与方法1.1 研究对象1.1.1 细胞株35 种宫颈癌细胞株(SiHa、HeLa、RJC-1、CS1213、C4-1)均由西安交通大学医学院第一附属医院实验医学中心
11、提供，其中 CS1213 和 RJC-1 细胞为该中心实验室自建5。1.1.2 临床病例选择 2003 年 9 月至 2004 年 5 月间西安交通大学医学院第一附属医院妇产科和肿瘤科初诊初治的宫颈癌患者 58 例，年龄 39-70 岁，均无内外科合并症。病理类型均为鳞状细胞癌；临床分期按国际妇产科联盟(FIGO)标准,2000 年：期18、期 24 例、-期 16 例；病理分级：级 10 例、级 22 例、级 26 例；有盆腔淋巴转移 7 例，无转移 51 例。正常对照 18 例为同期患良性子宫肌瘤或功能性子宫出血行全子宫切除术，术后宫颈组织病理检查报告为正常宫颈上皮，无其他疾病，年龄 38
12、-62 岁。1.2 研究方法1.2.1 标本采集宫颈癌细胞生长在 RPMI-1640 培养基(含 100mL/L 的新生小牛血清，100 u/mL 的青霉素，100 u/mL 链霉素)，37 ，5%(体积分数)的 CO2 条件下传代培养，收集时用 2.5 g/L(0.25%)胰蛋白酶消化，PBS 缓冲液洗涤，离心管(均经 DEPC 水处理，高压蒸汽消毒)收集，每支离心管细胞数达到 5106-10106。组织标本取宫颈癌患者手术切除或放疗前活检标本，避开坏死和炎症区域，组织块大小 0.5 cm0.5 cm0.3 cm，同法收集正常宫颈组织。收集的细胞及组织在 30 min 内置液氮中保存，所有标
13、本均经病理检查证实。41.2.2 引物设计FHIT 和 HPV16 基因的引物序列参照文献3，并与 GeneBank 中基因序列人工验证核实后，由上海生物工程公司合成，以 -肌动蛋白(-actin)作为内参照(表 1)。表 1 引物 DNA 序列（略）1.2.3 总 RNA 的提取采用 TrizoL 试剂(美国 Invitrogen 公司)提取总 RNA，于紫外分光光度计(美国Bio-RAD 公司) 测波长分别为 260 nm 和 280 nm 的吸光度(A)值，选用A260/A280 为 1.8-2.0 的样本用于 RT 反应。1.2.4 cDNA 的合成采用大连宝生物工程有限公司生产的 R
14、NA 反转录试剂盒，按说明书操作。电泳检测 cDNA 图像呈明显片状者用于 PCR 扩增，并于-20 保存备用。1.2.5 FHIT 基因扩增采用大连宝生物工程有限公司生产的 PCR 试剂盒进行巢式 PCR 扩增，第一轮和第二轮扩增反应体系均为 50 L，含试剂盒反应液 15 L，FHIT 基因引物和-actin 上、下游引物各 20 pmol，加灭菌水至 50 L，用 PE 2400 型扩增仪完成PCR 扩增，两轮扩增条件均为：94 预变性 2 min 后，94 变性 30 s，62 退火45 s，72 延伸 1 min，共 30 个循环，最后 72 延伸 5 min。1.2.6 回收和纯化
15、 FHIT 的转录片段随机选取扩增异常 FHIT 基因的 PCR 产物，经琼脂糖凝胶电泳后切下含有目5的 DNA 条带，用大连宝生物工程有限公司生产的纯化试剂盒纯化，由上海博亚生物工程公司进行产物测序。1.2.7 HPV16 基因扩增采用美国 Omega 公司试剂盒提取宫颈癌细胞及组织 DNA，测定 A260/A280值并计算 DNA 浓度，1-5 g 的 DNA 用于 PCR 扩增，检测 HPV16 DNA。1.2.8. 统计学处理采用 SPSS10.0 进行统计分析，数据采用 2 检验，设定 =0.05 为统计检验的显著标准。2 结 果2.1 FHIT 基因 mRNA 的表达5 种人宫颈癌
16、细胞株均可检测出 FHIT 基因，其中 CS1213 和 RJC-1 细胞中为正常的基因转录片段，SiHa、HeLa 和 C4-1 细胞中为截短的基因转录产物。宫颈癌患者中有 FHIT 基因表达片段异常者 39 例(67.2%)，正常对照组无 1 例(0%)，两组之间有显著性差异(表 2)。表 2 宫颈癌和正常宫颈组织中 FHIT 基因表达改变和HPV16 感染的关系（略） 2.2 HPV16DNA 的检测宫颈癌细胞株 SiHa、RJC-1 有 HPV16 感染；宫颈癌患者中 HPV16 感染者 37例(63.8%)，正常对照组 1 例(5%)，两组比较存在显著性差异 P0.05)。宫颈癌组织中有 HPV16 感染患者的 FHIT 基因表达异常数为 30/37，显著高于 HPV16 未感染的患者(9/21)，FHIT 基因表达异常和 HPV16 感染之间有相关性(2=8.886, 6P0.01)。2.3 FHIT 基因异常和 HPV16 感染与宫颈癌
