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1、分 类 号 学 号 M200970216学校代码 10487 密 级硕 士 学 位 论 文黄芪丹参与硒对纳米氧化钛细胞毒性的抑制作用学 位 申 请 人： 何 重 午学 科 专 业：生 物 化 工指 导 教 师：黄 开 勋 教 授答 辩 日 期： 2012 年 1 月 6 日A Thesis Submitted in Partial Fulfillment of the Requirements for theDegree of Master of EngineeringRole of Milkvetch Root, Savia Miltiorrhiza and Selenite inProte
2、ction against Nano Titanium Oxide-induced Cell DamagePh.M. Candidate： Chongwu HeMajor ： Biochemical EngineeringSupervisor ： Prof. Kaixun HuangHuazhong University of Science and TechnologyWuhan, Hubei, P.R. ChinaJanuary， 2012独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽 我所知，除 文中已经标 明引用的内 容外，本论 文不包含任 何
3、其他个人或集体已经发 表或撰写过 的研究成果 。对本文的 研究做出贡 献的个人和 集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到，本声明的法律结果由本人承担。学 位 论 文 作 者 签 名 ：日 期 ： 年 月 日学位论文版权使用授权书本 学 位 论 文 作 者 完 全 了 解 学 校 有 关 保 留 、 使 用 学 位 论 文 的 规 定 ， 即 ： 学 校 有 权保 留 并 向 国 家 有 关 部 门 或 机 构 送 交 论 文 的 复 印 件 和 电 子 版 ， 允 许 论 文 被 查 阅 和 借 阅 。本 人 授 权 华 中 科 技 大 学 可 以 将 本 学 位 论 文 的 全 部
4、或 部 分 内 容 编 入 有 关 数 据 库 进 行 检索 ， 可 以 采 用 影 印 、 缩 印 或 扫 描 等 复 制 手 段 保 存 和 汇 编 本 学 位 论 文 。， 在 _ _年 解 密 后 适 用 本 授 权 书 。保 密本 论 文 属 于 不 保 密 。（ 请 在 以 上 方 框 内 打 “”）学 位 论 文 作 者 签 名 ： 指 导 教 师 签 名 ：日 期 ： 年 月 日 日 期 ： 年 月 日华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文摘 要纳米科技在给人类带来经济效益和社会效益的同时，也给环境和生物体本身造成危害，所以如何降低纳米生物毒性具有十分重要的科学意义和应
5、用价值。本文以HepG2 细 胞 为 对 象 ， 在 测 定 了 纳 米 TiO2 毒 性 的 基 础 上 ， 选 用 丹 参 、 黄 芪 提 取 液 配 伍亚硒酸钠进行干预，研究了它们降低毒性的效果及其初步机理，得到如下结果：1 通 过 MTT 检 测 细 胞 成 活 率 ， 考 察 不 同 浓 度 的 纳 米 TiO2 悬 浊 液 对 于 细 胞 的 毒性。结果表明纳米 TiO2 可明显抑制细胞生长， 0.25g/L 纳 米 TiO2 干 预 细 胞 的 成 活 率是 正 常 细 胞 的 58.8%（ P0.05） 。34吸光度（华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文0.90.80
6、.70.60.50.4 * * *#* *0.30.20.10.0*A B C D E F G H I J K组 别 对 应 组 分A 细 胞 组B 粉 尘 对 照 组C 500mg/mL 黄 芪 +375mg/mL 丹 参 组 +100nmol/L 硒 组D 1000mg/mL 黄 芪 +375mg/mL 丹 参 组 +100nmol/L 硒 组E 1000mg/mL 黄 芪 +375mg/mL 丹 参 组 +1000nmol/L 硒 组F 500mg/mL 黄 芪 +750mg/mL 丹 参 组 +100nmol/L 硒 组G 500mg/mL 黄 芪 +750mg/mL 丹 参 组 +1
7、000nmol/L 硒 组H 1000mg/mL 黄 芪 +750mg/mL 丹 参 组 +100nmol/L 硒 组I 1000mg/mL 黄 芪 +750mg/mL 丹 参 组 +1000nmol/L 硒 组J 750mg/mL 丹 参 组K 1000mg/mL 黄 芪 组图 6 药物浓度以及分组情况对细胞成活率的影响加 入 0.25g/L TiO2 作用细胞 1h， 后 按 上 表 加 入 药 物 进 行 处 理 ， 通 过 MTT 测量细胞成活率。 n=3）*表示与对照组之间 P0.05） ， 上 述 结 果 表 明 药 物 处 理 对 于 细 胞 凋 亡 有 一 定 的 抑 制 作
8、用 ，混合药剂组对于抑制凋亡效果相对占优，而即使浓度减半，其效果仍然 比单一成分好 。3.5*32.52# # * *1.510.50+#*图 8 细胞 caspase3 变化情况加入 0.25g/L TiO2 作用细胞 1h， 后 按 混 合 药 剂 组 、 半 剂 量 组 、 3 种 单 一 药 物 组 加 入 药 物 进 行 处 理 ，测量细胞 caspase3 活力。 （ n=3）*表示与对照组之间 P0.05） 。 药 物 干 预 组 吸 光 度 均 高 于 正 常 细 胞 对 照 组 ， 分 别 为 正 常 细 胞对 照 组 的 1.14 倍 （ P0.05） 。 而 药 物 干
9、预 组 分 荧 光 强 度 仍 强 于 正 常 细 胞 对 照组 ， 混 合 组 分 ， 半 剂 量 组 分 ， 丹 参 组 ， 黄 芪 组 和 亚 硒 酸 钠 组 分 别 为 正 常 细 胞 组 的 1.34倍 ， 2.13 倍 ， 2.11 倍 ， 2.18 倍 和 2.28 倍 （ P0.05） 。 药 物 干 预 组 吸 光 度 较 之 正 常 细 胞 组 仍 然 较 高 ， 其 吸 光 度 分 别 为 正 常 细 胞的 2.67 倍 ， 3.29 倍 ， 3.75 倍 ， 4.12 倍 和 4.11 倍 （ P0.05） ， 提 示 混 合 组 分 浓 度 减 半 之 后效 果 仍
10、与 单 一 组 分 相 似 ， 无 统 计 学 差 异 。 与 正 常 细 胞 相 比 较 ， 其 iNOS 活 性 仍 然 较 高 ，5 组 药 物 干 预 组 分 别 为 正 常 细 胞 组 的 1.26 倍 、 1.55 倍 、 1.64 倍 、 1.62 倍 以 及 1.64 倍（ P0.05） 。 表 明 药 物 组 分 对 于 GPx 活性有恢复作用，对机体清除自由基能力有回复作用。且混合组分效果较单一组分占优 势 ， 即 使 浓 度 减 半 其 效 果 仍 然 与 单 一 组 分 相 似 。 而 与 正 常 细 胞 GPx 活 性 比 较 ， 即使使用药物进行干预，仍然无法恢复到
11、正常细胞水平，表明药物仅能控制纳米 TiO2对 GPx 活性的影响，恢复其清除自由基的能力，却无法完全修复损伤。35302520+#* #* # # #* * *151050*图 13 GPx 变化情况加入 0.25g/L TiO2 作用细胞 1h， 后 按 混 合 药 剂 组 、 半 剂 量 组 、 3 种 单 一 药 物 组 加 入 药 物 进 行 处 理 ，测量细胞 GPx 变 化 情 况 。（ n=3）* *表示与对照组之间 P0.05） 。 表 明 混合 药 物 组 分 对 于 抑 制 粉 尘 对 细 胞 SOD 活力的损伤方面作用最明显，即使浓度减半，其 在 提 高 机 体 超 氧
12、 化 物 歧 化 酶 活 性 ， 清 除 自 由 基 的 能 力 方 面 ， 仍 然 与 单 一 组 分 相 似 。而 即 使 加 入 药 物 进 行 处 理 ， 其 SOD 活 力 仍 然 低 于 正 常 细 胞 ， 分 别 为 正 常 细 胞 组 的88.4%（ P0.05） 、 80.1%、 81.7%、 81.8%和 81.8%（ P0.01） ， 表 明 药 物 组 分 能 够 减缓纳米 TiO2 对 于 机 体 SOD 活力的损伤，但是却无法完全恢复其正常活性。6050+# # # #* * * * #*403020100*图 14 SOD 变化情况加入 0.25g/L TiO2
13、作用细胞 1h， 后 按 混 合 药 剂 组 、 半 剂 量 组 、 3 种 单 一 药 物 组 加 入 药 物 进 行 处 理 ，测量细胞 SOD 变 化 情 况 。（ n=3） *表 示 与 对 照 组 之 间 P0.01，*表示与对照组之间 P0.05，# #表示与染尘组分之间 P0.01，+ 表示与单一组分之间 P0.053.10 讨论有研究认为，若粉尘与生物体细胞产生较强的生物化学作用，即表现出生物活性 (biological activity)，生物活性与细胞毒性有关。生物活性越高，其对人体的危害也 就 越 大 58。经过分析纳米 粉尘对细胞氧化损伤和破坏免疫能力方面的 作用机理。
14、 一般认为43华 中 科 技 大 学 硕 士 学 位 论 文细 胞 吞 噬 纳 米 粉 尘 微 粒 之 后 形 成 的 尘 细 胞 ， 在 和 溶 酶 体 融 合 之 后 ， 形 成 次 级 溶 酶 体 。粉尘表面各种带电基团的生物活性即开始作用， 产生过氧化脂质反应，与酶体膜的磷脂或蛋白质形成氢键，破坏巨噬细胞膜结构，这样可以改变膜通透性使其通透性增强，当细胞内外粒子浓度发生爆发，溶酶小体将崩解。崩解之后细胞将重新释放出 粉 尘 粒 子 ， 并 且 伴 随 着 多 种 细 胞 因 子 被 激 活 。 粉 尘 粒 子 继 续 被 新 的 巨 噬 细 胞 吞 噬 ，再崩解，形成恶性循环。而释放出
15、的各种细胞因子将会促进炎症的表达，刺激致纤维化因子和溶酶的过度表达。当成纤维细胞被过度刺激，就开始产生恶性增殖，器官 内 形 成 大 量 纤 维 状 网 络 。 随 着 粉 尘 积 累 ， 病 症 持 续 发 展 ， 最 终 纤 维 网 络 相 互 融 合 ，变性，形成胶原纤维和胶原结节，改变器官的内空间和血管的形态。并在机体自然修复的同时，发生反复器官损伤，进而产生一系列其他疾病。细胞一旦接触 纳米粉尘，皆会引起细胞生物效应的改变，从而引起氧化失衡和一系列代谢分子的产生，这一系列的变化会引起细胞各项生物指标的改变，直接的反 映 就 是 细 胞 形 态 和 成 活 率 的 变 化 。 从 本 文 研 究 以 及 一 些 文 献 显 示 ， 粉 尘 浓 度 越 高 ，单位浓度细胞接触的粉尘几率越大，从而生物效应的改变越剧烈，产生对细胞毒性也 越 大 ， 细 胞 凋 亡 程 度 也 就 越 大 ， 相 应 的 ， 细 胞 的 成 活 率 也 就 越 低 。董静等 59利用丹参水煎液灌胃干预小鼠肺纤维化，发现丹参水煎液可以降低小鼠肺组织核因子- B（ NF-B）的过度作用，从而控制肺纤维化的程度。另外，通过丹 参 素 来 治 疗 大 鼠 肺 纤 维 化 模 型 ， 进 行 药 物 干 预 之 后 ， 干 预
