《TGFβ1、TGFβR1、Smad4在乳腺癌发生、发展中的作用及其相互关系》由会员分享，可在线阅读，更多相关《TGFβ1、TGFβR1、Smad4在乳腺癌发生、发展中的作用及其相互关系（8页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、1TGF1、TGFR1、Smad4 在乳腺癌 发生、发展中的作用及其相互关系作者：夏立平，刘晓力，陈国平，郑武平，何冬雷，高炳玉【摘要】 目的：探讨 TGF 1、TGF R1 及 Smad4 三者在乳腺癌中的表达与其发生、发展、转移等生物学行为以及预后的关系，为乳腺癌发病和治疗机制提供理论和实验依据。方法：提取 30 例乳腺癌临床标本（经液氮、研磨等处理）和MCF 7、T47D、SKBR 3 三种乳腺癌细胞（取指数增长期细胞）总 RNA，反转录cDNA 第一链，克隆 TGF R1、Smad4 基因片段，测定质粒浓度，制备标准样品，并作出标准曲线，探针法荧光定量 PCR（FQ PCR）检测 TG
2、F R1 和 Smad4 基因 mRNA 表达。结果：FQ PCR 检测发现恶性程度高的 SKBR 3 细胞，其TGF R1 和 Smad4 的基因拷贝数明显低于恶性程度低的 MCF 7 细胞（P 均0.01），T47 细胞两种基因拷贝数介于两者之间。结论：随着乳腺癌细胞病理类型恶性程度增加，TGF R1 和 Smad4 mRNA 表达逐步下降，表明 TGF 1 和Smad4 可能具有类似乳腺癌抑癌基因的作用。 【关键词】 转化生长因子 1; 转化生长因子 1 受体; Smad4; 乳腺癌ABSTRACT Objective: To investigate the expression of
3、TGF 1, TGF R1 and Amad4 proteins and the relationship to the initiation, progression, metaptosis and prognosis of breast cancer. Methods: The samples of 30 cases and 3 cell lines(MCF 7,T47D,SKBR 3) of breast cancer were selected, and the total mRNA was extracted. Reverse transcription, and TGF R1 an
4、d Smad4 genes cloning were carried out. Then the concentration of plasmid was measured, standard curve was made, and the expression of TGF R1 and Smad4 mRNAs were assayed by FQ PCR machine. Results: The gene copies of TGF R1 and Smad4 in SKBR 3 cells were lower than that in MCF 7 cells (P0.01) and t
5、he gene copies in T47 was middle. Conclusions: Our studies by FQ PCR show that the lower TGF R1 and Smad4 2mRNAs expression, the worse biology characteristic of breast cancer, which indicate TGF R1 and Smad4 act possibly as the role of anti oncogene in breast cancer.KEY WORDS TGF 1; TGF R1; Smad4; B
6、reast cancer乳腺癌是女性常见恶性肿瘤之一，全世界每年约有 120 万妇女患乳腺癌。目前，乳腺癌病因尚不十分清楚，发病机理非常复杂，涉及多个因素的作用。多数研究认为，乳腺癌的发生是因为原癌基因的激活和抑癌基因的功能丧失，其发展是一个多因素多阶段的过程，往往涉及多个基因的改变1,2。TGF /Smads 信号传导通路及其与肿瘤关系多见于胰腺癌、妇科肿瘤等3,4，而在乳腺癌中TGF 1、TGF R1 及 Smad4 三者的表达及其相互关系如何，它们对乳腺癌发生、发展有何意义，目前还不完全清楚。本实验拟采用荧光定量 PCR (fluorescent quantitation polymer
7、ase chain reaction，FQ PCR)、免疫组织化学/免疫细胞化学、Western Blotting 等技术，检测乳腺癌患者和乳腺癌细胞株中的TGF 1、TGF R1 和 Smad4 在 mRNA 水平和蛋白水平表达，进一步深入三者在乳腺癌中的表达与其发生、发展、转移等生物学行为以及预后的关系，为探讨TGF 信号转导过程提供新的思路，同时为乳腺癌的 Smad4 基因导入治疗，以及尝试应用 iRNA 技术，提供理论和实验依据1 材料与方法1.1 材料1.1.1 标本和细胞本组乳腺癌临床标本共 30 例，全部为海南医学院附属医院 2005 年 1月2008 年 12 月门诊或住院患者
8、，其中外科手术切除标本 25 例，病理活检标本5 例。患者年龄 2460 岁，中位年龄 43 岁；按照病理学类型分为非浸润性癌 4 例、3早期浸润性癌 6 及浸润性癌 20 例。乳腺癌细胞株 MCF 7、T47D、SKBR 3 细胞为本实验室保存。正常对照：选取非乳腺癌患者正常乳腺组织手术切除标本 10 例作为对照。1.1.2 质粒和细菌pGEM T TGFR1 、pGEM T Smad4 质粒构建按照 pGEM T 载体试剂盒（公司）的说明。大肠杆菌 DH5 为本实验室保存。1.1.3 引物和探针以 Genebank 中 Smad4 和 TGF R1 基因 的 mRNA 序列作参考，各设计一
9、对引物和一条探针。Smad4 上游引物(P1)：5 GTCGAAAACAACGCTATTGACT 3； 下游引物(P2)：5 CAGAGAATTGTCGCCGTACAT 3； 荧光探针：5 TCAGGACGCGATACCTCGGTATACC 3。 TGF R1 上游引物(P1)： 5 GAACGACAACGATTCAACT 3； 下游引物（P2）：5 GCAACACGATCATGACTT 3； 荧光探针为5 TCTACGTAATAGCATGCGCCAAAT 3。探针 5端标记的荧光报告基团均为 FAM，3端标记的荧光淬灭基团均为TAMRA。引物及探针均由英俊公司合成。1.1.4 主要试剂RPM
10、I 1640 培养基（GIBCO BRL 公司）；无支原体胎牛血清（杭州四季青公司）；HEPES 粉（ASBC 进口分装）；PBS 缓冲液（NaCl 8.0g, Na2HPO412H2O 3.63g, KH2PO4 0.2g, pH7.4，自配）；胰蛋白酶（Sigma 公司）；EDTA（公司）；TRIzol 4Reagent（Invitrogen 公司）；DEPC（威佳公司）；氯仿（国产）；异丙醇（国产）；RT 试剂盒（Fermentas 公司）；Taq 酶（Progema 公司）；DNA Marker（威佳公司）；Gel Estration Kit 和小量质粒抽提试剂盒（QIAGEN 公司）
11、；PCR 产物纯化试剂盒（博彩生物公司）。1.1.5 仪器二氧化碳孵箱（Hereaus B5060EK/CO2）； 倒置相差生物显微镜（Olympus 公司）； 紫外/可见光分光光度计（Beckman DU530）； 荧光定量 PCR 仪（ABI 公司）； 数显调速多用振荡器（江苏金坛荣华仪器制造有限公司）； 台式低温高速离心机（Hermle 和 Beckman 公司）； PCR 扩增仪（PE9600）； 多功能恒温恒压恒流电泳系统（Bio Rad 和 Phatmacia 公司）； 凝胶成像系统（英国 UPV GDS 7500）； 凝胶图像光密度分析仪（UVP GDS 型，英国）； 微量加样器
12、（Eppendorf 公司）； 96 孔培养板（美国 Becton Dickinson 公司）。1.2 方法1.2.1 乳腺癌组织标本处理乳腺癌组织标本经液氮、研磨等处理，用于实时荧光定量 PCR 检测。1.2.2 乳腺癌细胞株培养37 ，5%CO2 环境下，用含 10%胎牛血清的 RPMI 1640 液培养MCF 7、T47D、SKBR 3 细胞，取处于指数增长期细胞用于实时荧光定量 PCR检测。1.2.3 总 RNA 的提取及分析5取 5m3 乳腺癌组织块或 1106 个乳腺癌细胞，PBS 洗涤 3 遍，去上清 1mL 的 TRIzol 溶解细胞，1mL 的注射器反复抽提数次； 加入 20
13、0L 的氯仿，剧烈振荡 30s，12000r/min 室温离心 5min。 吸上清于 RNase free 的 EP 管中，加入等体积的异丙醇，室温放置 5min，12000r/min 室温离心 5min； 70酒精700L 洗涤沉淀，12000r/min 室温离心 5min，共 2 遍； 吸上清，室温放置将酒精风干； 3050L 的 DEPC 水溶解 RNA，取少许 RNA 溶液测定 A260/A280值。1.2.4 反转录 cDNA 第一链取 4g 总 RNA，1L 的 oligo(dT)18 混合于置于冰上的 EP 管中，加 DEPC水至 12L，轻轻混合并简短离心； 70温育 5min
14、，置于冰上少许，简短离心； 加入 5buffer 4L，RNase 抑制剂 1L 和 10mM 的 dNTP2L，轻轻混合并简短离心； 37温育 5min，加入 M MuLV 逆转录酶 1L（反应体系共 20L），42温育 60min，70温育 10min。1.2.5 TGF R1、Smad4 基因片段的克隆和质粒浓度的测定分别用 TGF R1、Smad4 引物，从合成的 cDNA 上扩增出TGF R、Smad4 基因片段，扩增体系如下 cDNA2L； dNTP0.5L； 10Buffer2.5L；引物 P11L；引物 P21L； 引物 P51L； 引物 P61L； Taq 酶 0.5L； d
15、dH2O 15.5L； 总体积 25L； PCR 反应条件： 高温预变性时间 95 3min； 变性温度与时间 94 45s； 退火温度与时间 5445s； 延伸温度与时间 721min； 反应循环数：30 个。基因片段纯化按照优晶公司 Gel Extraction Kit 6试剂盒说明书操作。 分别取纯化后的 PCR 产物 8L，按照 pGEM T 载体试剂盒的说明，构建 pGEM T TGFR1 、pGEM T Smad4 质粒。 转化大肠杆菌 DH5，挑取阳性克隆子，提纯质粒并进行 PCR 和测序鉴定（测序工作由英俊公司完成）。纯化的质粒作为标准样品，其用 Beckman 公司分光光度计
16、测得核酸浓度。1.2.6 标准样品的制备以提纯的 pGEM T SMAD 4、pGEM T TGFR，按 10 倍系列稀释为101107copies/L 作为标准样品，进行荧光定量 PCR 扩增。扩增结束后，分别以 pMD18 T SMAD 4、pMD18 T TGFR 起始模板浓度(单位为 copies/L) 作为 x 轴，Ct 值为 y 轴作回归曲线，制作标准曲线。 1.2.7 荧光定量 PCR 检测将标准样品、待测样品及无模板对照在荧光定量 PCR 仪（ABI 公司）上做荧光定量 PCR 扩增。反应体系及条件如下。cDNA2L； dNTP0.5L； Takara PCR premix buffer12.5L； 引物 P1(60nmol/L) 2L； 引物 P2(60nmol/L) 2L； 探
