nm23H1等位基因缺失与喉癌转移相关性研究

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1、1nm23H1 等位基因缺失与喉癌转移相关 性研究作者：徐艳萍 金春顺 孙立群 许亚辉 孟粹达【摘要】 目的 从基因水平探讨 nm23 H1 等位基因缺失与喉癌转移的相关性。方法 采用 Southern 杂交技术检测 30 例喉癌组织中 nm23 H1 等位基因缺失情况。结果 颈淋巴结转移组的喉癌组织中 nm23 H1 等位基因缺失率为 44.4%(4/9)，明显高于无颈部淋巴结转移组 4.8%(1/21)，两组比较差异有统计学意义(P0.05)。nm23 H1 等位基因缺失与临床分型、分期及病理分化程度无显著性相关(P0.05)。结论 nm23 H1 基因在抑制喉癌转移方面起重要作用，nm2

2、3 H1 等位基因缺失可作为喉癌转移潜能及预后判定的重要指标之一。 【关键词】 喉肿瘤;肿瘤转移;nm23 基因;基因缺失nm23 基因目前被认为是最有意义的转移抑制基因，由美国国立癌症研究所 Steeg等1于 1988 年首先从 K 1735 鼠恶性黑色素瘤细胞株中，用消减杂交法分离鉴定出来的。相关研究报道 nm23 基因与黑色素瘤、肺癌、肝癌等多种人类肿瘤转移相关13，但关于 nm23 H1 等位基因缺失与喉癌转移的关系，目前国内未见报道。本研究应用 Southern 杂交技术检测国人喉癌组织中 nm23 H1 等位基因缺失情况，并探讨其与喉癌转移的相关性。1 材料与方法1.1 一般资料

3、30 例喉癌组织及相应的正常喉黏膜组织取自本院耳鼻喉科住院手术病人，均经病理证实为喉鳞状细胞癌。术中取喉癌组织及距肿瘤边缘1 cm2的正常黏膜，标本置于-80保存备用。男 21 例，女 9 例，年龄 4076 岁，平均年龄 61 岁，按 1987 年国际抗癌协会(UICC)的 TNM 解剖分区、分期及分级标准。声门上型 26 例、声门型 4 例;临床分期：期 3 例，期 7 例，期 10 例，期 10 例;肿瘤分化程度：高分化 12 例，中分化 12 例，低分化 6 例。颈淋巴结转移组 9 例均为术前即有淋巴结转移(术后经病理证实)，或术后 1 年内又出现颈淋巴结转移的病人，非转移组 21 例

4、，为原发肿瘤切除后 1 年内无局部复发和颈部淋巴结转移的病人。1.2 探针及同位素标记试剂盒 nm23 H1 cDNA 探针由北京医科大学提供，片段长度 900 bp，BamH 酶切，随机引物同位素标记试剂盒为 Sigma 公司生产。1.3 Southern 印迹法分析 提取所有癌组织、正常黏膜标本的 DNA，取 20 g DNA 经 Bgl酶切完全后，0.8%琼脂糖凝胶电泳，用毛细管转移法将凝胶中的DNA 转移至尼龙膜上。42预杂交 24 h,预杂交液成分为 25 mmol/L K3PO4，5SSC，0.5%SDS，5Denhardt，50 g/ml 变性的鲑精 DNA，50%甲酰胺。用随机

5、引物标记法将 32P dCTP 标记到 nm23 H1 cDNA 探针上。过柱纯化探针，热变性后加入到预杂交袋内，42杂交 24 h。用 2SSC、0.1%SDS 洗膜 5 min，改用 0.1SSC、0.5%SDS 在室温、42及 65洗膜至杂交带区与膜本底的放射性显出差异，将尼龙膜与 X 线胶片置暗盒内，-70放射自显影 1014 d。显影、定影，读片。1.4 统计学分析 采用 fisher 检验及秩和检验。2 结 果32.1 基因组 DNA 酶切结果 上述组织的基因组 DNA 经 Bgl酶切，与nm23 H1 cDNA 探针 Southern 杂交显示，在杂合子出现 7.6 kb 及 2

6、.3 kb 两条杂交带，而在纯合子则为单 7.6 kb 或单 2.3 kb 杂交带，与正常黏膜组织相比癌组织杂交带缺失则为等位基因缺失。5 例喉癌病人存在 nm23 H1 等位基因缺失，其中颈淋巴结转移组喉癌组织中的 4 例及相应的淋巴结中的 3 例存在 nm23 H1 等位基因缺失;非转移组喉癌组织中 1 例存在 nm23 H1 等位基因缺失，均为杂合性缺失。2.2 nm23 H1 等位基因缺失与喉鳞癌临床疗效的关系 nm23 H1 等位基因缺失与肿瘤的临床分型、分期及病理分化程度无显著相关性(P0.05)，见表 1。转移组中 4 例喉癌组织存在 nm23 H1 等位基因缺失，而非转移组 2

7、1 例中仅 1 例喉癌组织存在 nm23 H1 等位基因缺失，两组比较差异有统计学意义(P0.05)。表 1 nm23 H1 等位基因缺失与喉鳞癌病理及临床特点的关系等位基因缺失无等位基因缺失 P 值临床分型声门上型 5210.05 声门型 04临床分期030.05163719 病理分化程度高 1110.05 中 39 低 15 喉癌组织转移组 450.05 非转移组 120 3 讨 论nm23 基因是近年来分离鉴定的一种与肿瘤转移表型抑制相关的基因1，现已鉴定出两种亚型即 nm23 H1 和 nm23 H2。nm23 H1 定位于 17 号染色体的长臂(17q22)，在转移性肿瘤中 nm23

8、 H2 的表达减少不如 nm23 H1 明显。nm23 H1基因在某些具有高转移特性的人类肿瘤细胞中可发生表达下降、等位基因缺失及基因突变等三种形式的改变。Leone 和 Wang 等4，5发现在人类乳腺癌、非小细胞肺癌、肾癌、结肠癌中有 nm23 H1 等位基因缺失的现象。缺失率在不同的肿瘤4有着很大差异，从 8%52.4%不等。这些等位基因缺失与肿瘤的转移有关，nm23 H1 经 Bgl酶切产生 7.6 kb 和 2.3 kb 片段6。本研究中 30 例喉癌组织中 5 例存在 nm23 H1 等位基因缺失，缺失率为 16.7%，较 Scholnick 等7的报道(7%)略高，与徐文怀等8报

9、道在大肠癌中 nm23 H1 等位基因缺失率的结论相符。nm23 基因表达与多种肿瘤的转移表型呈负相关。在非小细胞肺癌(NSCLC)的研究中发现有淋巴结转移的 NSCLC 中 nm23 H1 等位基因缺失率明显高于不伴淋巴结转移的肺癌患者2。最近研究发现食管癌早期nm23 表达水平增加，随着肿瘤的进展及转移，nm23 表达明显下降9。胡俊兰10、李钦11在喉癌的研究中发现颈淋巴结转移组较非转移组 nm23 的表达下降，组间的差异有显著性。提示 nm23 H1 蛋白表达与喉癌颈淋巴结转移呈负相关。本研究颈淋巴结转移组 9 例中 4 例喉癌组织存在 nm23 H1 等位基因缺失，缺失率为 44.4

10、%;非转移组 21 例中只有 1 例喉癌组织存在 nm23 H1 等位基因缺失，缺失率为 4.8%，转移组与非转移组间缺失率差异有显著性意义(P0.05)。表明nm23 H1 等位基因缺失与喉癌转移密切相关，nm23 基因可能在喉癌转移过程中发挥重要作用，nm23 H1 在喉癌中等位基因缺失的机制不清，可能因基因组中某一 DNA 片段的丢失及酶切位点丢失等因素使 nm23 抑制肿瘤转移作用解除，其影响的细胞微管聚合和 G 蛋白介导的信号传递加强，致使细胞染色体非整倍体形成引起细胞运动，导致肿瘤的浸润、转移。非转移组中有 1 例存在 nm23 H1 等位基因缺失，该患在术后 2 年局部肿瘤再发，

11、这是否可能提示 nm23 不仅能抑制肿瘤的转移而且也能部分抑制肿瘤的形成。本研究结果还显示 nm23 H1 等位基因缺失与临床分型、分期及病理分化程度无显著相关，但中、低分化鳞癌 nm23 H1等位基因缺失率有增高的倾向。5综上所述，nm23 H1 可能在抑制喉癌转移方面发挥重要的作用，其等位基因缺失与喉癌转移密切相关，可作为喉癌转移潜能及预后判定的重要指标之一。【参考文献】1 Steeg PS,Bevilacqua G,Kopper L,et al.Evidence for novel gene associated with low tumor metastatic potentialJ.

12、J Natl Cancer Inst,1998;80;200 4.2 梅同华,李长毅.非小细胞肺癌 nm23 H1 等位基因缺失与淋巴结转移关系的研究J.第三军医大学学报，2005;27(12):1266 8.3 Yamaguchi A,Vramo T,Goi T,et al.Expression of human nm23 H,and nm23 H：proteins in hepatocellutar carcinomaJ.Cancer,1994;73:2280 4.4 Leone A,Mcbride OW,Weston A,et al.Samatic allelic of nm23 del

13、etion in human cancerJ.Cancer Res,1991;51:2490 3.5 Wang LM,Patel U,Ghosh L,et al.Mutation in the nm23 gene is associated with metastais in colorectal cancerJ.Cancer Res,1993,53:717 20.6 Varesco L,Caligon MA,Sim P,et al.The nm23 gene maps to human chromosome band 17q22 and shows a restriction fragmen

14、t lenth polymorphism with Bg1J.Genes Chrom Cancer,1992;4:84 8.7 Scholnick SB,Sun PC,Shaw ME,et al.Frequeet loss of hoterozygosity for Rb、TP53 and Chromosome arm3p,but not NME1 in squamous cell carcinoma of the supraglottic largnxJ.Cancer,1994;73:472 80.8 徐玉怀，白景香，杨定成,等.nm23 H1 等位基因缺失与大肠癌转移相关性研究J.中华肿瘤

15、杂志，1995;17：263 5.9 Sarri M,Konopka M,Lee CS.Differential expression of the nm23 protein in the progression of oesopha geal adenocarcinomaJ.Pathology,2003;35:37 41.10 胡俊兰，赵瑞力，施惠晶,等.CD44v 和 nm23 H1 基因蛋白在喉癌中的表达及临床意义J.中华耳鼻咽喉科杂志，1999;34：362 4.611 李 钦，陈彦林，孔 平,等.HER 2/neu 和 nm23 蛋白在喉鳞状细胞癌中的表达及与浸润转移的相关性J.临床耳鼻咽喉科杂志，2006;20(6)：259 61.