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1、1胃癌腹膜高转移潜能细胞系的建立及其 生物学特性【摘要】 目的 利用人胃癌细胞系（GC9811）在裸小鼠体内反复接种建立一株具有腹膜高转移潜能的胃癌细胞系(GC9811 P)，并对其生物学特性进行观察，为实验研究提供模型。 方法 采用胃癌细胞系(GC9811)在裸小鼠腹腔内反复接种，行体外培养腹膜转移灶筛选高转移亚系，绘制细胞生长曲线，光镜、电镜下观察细胞形态，利用流式细胞仪、染色体分析等方法，研究该高转移亚系的细胞周期、增殖、染色体核型等生物学特性。结果 母本细胞系 GC9811 腹膜转移形成率为33.3%(3/10)，而 GC9811 P 腹膜转移形成率为 100%。两种细胞系腹膜结节组织
2、学形态大体相似。增殖速度较母系加快。细胞周期分析 G1 期 53.5%、G2 期12.5%、S 期 37.1%。且遗传学特性包括染色体形态仍为人类核型，众数维持在104126 之间，占 70%。结论 具有腹膜高转移的胃癌细胞系 GC9811 P 的建立及裸小鼠体内实验模型，为研究胃癌腹膜转移机制及探索新的治疗途径提供了极为有用的工具。 【关键词】 胃癌 腹膜转移 细胞系0 引言为研究胃癌浸润与转移机制及探索阻断其浸润与转移策略，本研究采用胃癌细胞系 GC9811 细胞悬液于腹腔接种，经体外培养腹膜转移结节，成功地建立了胃癌腹膜高转移细胞系 GC9811 P，并对其生物特性进行了初步鉴定。1 材
3、料和方法21.1 细胞系和细胞培养 GC9811 人胃癌细胞系由西京医院全军消化病研究所提供，细胞置 20%小牛血清的 RPMI 1640 培养液中于 CO2 恒温孵箱中培养，常规传代；BALB/C NU/NU 裸鼠，由中国生物药品鉴定所提供，鼠龄 35 周，体重 1520g，雌雄兼用，其实验和饲养均在 SPF 条件下的超净层流架中进行，无菌食物和水由裸小鼠自由摄取。1.2 方法1.2.1 高转移亚系的筛选 用 0.02%EDTA 和 0.125%的胰蛋白酶联合消化对数生长期的 GC9811 细胞，用无血清的 RPMI 1640 培养液洗涤 3 次，制备成 1107细胞悬液，接种于裸鼠腹腔，3
4、 周后，裸鼠出现全身衰竭，断颈处死，收集腹膜瘤结节行体外培养，获得的细胞系命名为 GC9811 P1，于体外培养 23 代后，收集细胞再行裸鼠腹腔接种，用同样的方法重复 4 次，得到高转移细胞系GC9811 P4。采用有限稀释法，在 96 孔板中将 GC9811 P4 细胞稀释成每孔含0.51 个细胞，次日在倒置显微镜下观察并挑选只含一个细胞的孔，待细胞增殖近面积 1/3 时，移至 24 孔板中扩大培养，得到胃癌腹膜高转移细胞株GC9811 P。1.2.2 形态学检查 每只裸鼠均详细解剖，对肉眼未发现转移灶的肺脏进行连续切片，癌组织石蜡包埋、切片、HE 染色，培养细胞用倒置显微镜观察，收集对数
5、生长期的细胞，用 30ml/L 的戊二醛固定，树脂包埋，超薄切片并染色，以日立JEM 2000 型透视电镜及扫描电镜观察细胞超微结构。1.2.3 细胞增殖特性的研究 用 MTT 法测定细胞生长曲线。调整 GC9811 与GC9811 P 细胞浓度,分别按 1103 个细胞/孔接种于 96 孔板中，每孔加 200l 培3养液，置 37、CO2 孵箱中培养，每个样品重复 3 孔，每天用 MTT 比色法测定 3孔中的 A 职（为 490nm），绘制细胞生长曲线。流式细胞仪测定细胞周期及 DNA含量：收集对数生长期的 GC9811 与 GC9811 P 细胞用 0.125%胰蛋白酶和0.02%EDTA
6、 溶液联合消化细胞，制备单细胞悬液，用 PBS 洗涤两遍，垂悬于5ml、4预冷的 PBS 中，95%的乙醇固定，调整细胞数为 1105/ml，经溴化乙锭染色后，在流式细胞仪上测定细胞周期及 DNA 含量。1.2.4 体外侵袭实验 参照 Albini 等体外侵袭实验方法。Boyden(Biotech 公司)小室上下室之间铺有直径为 6.5mm 的聚碳酸酯微孔滤膜（孔径为 8m），膜上均匀铺人工基底膜胶（matrigel）50/孔，下室加入 NIH3T3 细胞无血清条件培养上清 200l 作为趋化因子，将小室置于 37温箱中聚合 30min。收集对数生长期细胞，调整细胞浓度为 5105/ml，向上
7、室中加入细胞悬液 400l，37，5%CO2 孵箱中放置 12h。弃上室液体，拭尽膜上未侵袭的细胞及人工基底膜胶，甲醇固定30min，常规 HE 染色。每个细胞同时做 3 个小室，200 倍光镜下将膜以水平线及垂直线分为 4 个象限，在每个象限及膜中心取 1 个视野记数，取其均值。1.2.5 染色体分析 取对数生长期的 GC9811 P 细胞，按文献2所述方法制片，镜检 100 个分散良好且完整的中期分裂相进行染色体分析。1.2.6 双层琼脂试验 按常规方法检测克隆形成率。1.2.7 支原体检测 采用透射电镜、地依红染色及肉汤培养法检测培养液及细胞内支原体。1.2.8 体内成瘤性检测 将生长旺
8、盛的 GC9811 与 GC9811 P 细胞制成 0.2ml4细胞悬液（含 106107 个细胞）接种于 12 只 34 周龄的裸鼠背侧或腋下皮下，观察致瘤性，瘤结节每五天用卡钳测量肿瘤长径 a 和短径 b 并用公式 W（瘤重）=（ab2）/2 计算肿瘤重量，绘制肿瘤生长曲线。2 结果2.1 腹腔移植模型的建立 将 GC9811 细胞系在裸鼠腹腔内种植，连续传代后，出现全身消瘦、呼吸困难和衰竭的时间平均为 26 天。GC9811 P6 于腹腔接种 19天后，大体解剖可见腹腔脏器广泛转移，腹膜可见多个直径约 0.10.5mm 大小不等的灰白色转移结节，伴有血性腹水形成（图略）。病理检查可见与母
9、系腹膜转移结节组织学形态大体相似，见图 1，实验过程中，所有动物出现全身衰竭后脱颈处死，双肺连续切片只见到大量炎细胞浸润。2.2 异位移植环境对转移的影响 见表 1。表 1 GC9811 细胞悬液皮下、腹腔和胃浆膜下接种后生长与转移比较（略）2.3 各代裸鼠腹腔接种的成功率及转移情况 见表 2。表 2 各代胃癌细胞系于裸鼠腹腔接种后的转移率（略）2.4 腹膜转移克隆株的获得 GC9811 P6 经体外传 10 代并去除成纤维细胞后，96 孔板克隆化培养，获得 4 株克隆，其中一株生长力旺盛、增殖较快，裸鼠成瘤率高，潜伏期短。命名为胃癌腹膜高转移株 GC9811 P。 2.5 细胞形态特点 GC
10、9811 与 GC9811 P 在相差显微镜下比较形态大致相似，活细胞以不规则、延伸出一到多个长短不等触角的上皮样细胞为主，有少量梭形细胞，生长的单层细5胞有重叠生长能力。细胞核异型性明显，胞浆可见丰富的颗粒及空泡，见图 2。扫描电镜观察，细胞表面有丰富的微绒毛。透视电镜示细胞核及核仁增大而有异形性，胞质较少，含有较多的线粒体，胞浆内有丰富的核糖体，可见核分裂相。2.6 细胞增殖特性研究 取对数生长期 GC9811 与 GC9811 P 细胞绘制生长曲线，计算群体倍增时间分别为 19.5h 和 18.6h。流式细胞仪分析细胞周期时相、增殖指数，见表 3。并可见典型的非整倍体细胞峰，两种细胞 D
11、NA 倍体类型未见明显差别。表 3 两种细胞系细胞周期的分布与增殖指数（略）2.7 体外侵袭实验 GC9811 和 GC9811 P 穿过人工基底膜的侵袭细胞数分别为(7321）个和（10316）个。t 检验显示两者之间差异具有显著性（P0.05）。2.8 染色体分析 移植瘤连续传代后，染色体仍保持人肿瘤染色体的特点，分析第 53 代细胞 100 个中期分裂细胞的染色体，数目分布在 58126 条之间，众数为 104126 之间，占 70%，主干系为五倍体，异常染色体出现频繁。2.9 双层琼脂试验 第 85 代细胞双层琼脂培养 12d，细胞克隆形成率约 59%。2.10 支原体检测 培养液及细
12、胞内支原体均为阴性。2.11 致瘤性与转移性 皮下接种的 12 只裸鼠一周左右均出现瘤结节，以后生长明显增快，30 天后 GC9811 肿瘤重量较 GC9811 P 明显增快，见图 3。图 3 皮下肿瘤生长曲线（略）63 讨论在探究胃癌腹膜转移机制过程中，目前虽已建立了几种动物转移模型1 4， 但仍对其转移和侵袭的发生机制及其发展规律缺乏深入的认识。腹膜转移表现在它除一般的细胞增殖以外，还有肿瘤细胞的脱落、游离癌细胞粘附到腹膜着床、侵袭生长以及肿瘤周围血管的生成等多个病理步骤5，6。本模型采用人胃癌细胞悬液腹腔注入的方法，模拟了自由癌细胞脱落入腹腔后的过程。临床中并非所有的腹腔游离癌细胞均可形
13、成腹膜转移瘤,肿瘤转移中有众多的因子参与，彼此之间形成错综复杂的调控网络7。肿瘤异质学说认为：在同一肿瘤内，存在着转移性和侵袭性不完全相同的多种细胞亚群，当在一定的内外环境下促使某种细胞亚群变为占优势的肿瘤细胞亚群，转移便可发生。本实验在此理论基础上，癌细胞经腹腔连续传代，随着腹膜转移率增高的演进，得到一株腹膜高转移细胞株GC9811 P。人肿瘤细胞侵袭和转移一方面需具备合适的微环境，另一方面还须依赖肿瘤细胞之间、肿瘤细胞与宿主之间的相互作用，肿瘤的侵袭和转移与肿瘤细胞所处微环境之间有着密切的关系，而且不同的组织微环境可能是肿瘤细胞生物学行为差别的主要因素8。本文结果可见，裸鼠皮下荷瘤较长时间
14、（60 天）未见转移发生，主要因为皮下血供条件和淋巴引流较差。未见肺转移的原因可能为：瘤细胞本身不具备肺部转移的生物学特性；裸鼠体内免疫力有效遏制了转移；接种部位的微环境影响；荷瘤鼠未及转移就已死于恶病质。GC9811 P 与母本细胞系 GC9811 相比较，前者细胞增殖指数增加，腹腔接种7潜伏期短、成瘤快，生长曲线属于无限细胞系曲线，细胞倍增时间较短。透视电镜示含有丰富的微绒毛、较多的线粒体，胞浆内有丰富的核糖体，可见核分裂相。流式细胞仪结果证明其 DNA 合成旺盛，恶性程度较高。染色体分析是确立细胞系的重要指标。GC9811 P 染色体分析结果符合恶性细胞系的特点。体内外实验结果证实，GC
15、9811 P 较母本细胞系的体外侵袭能力强，腹膜转移率高；而体外生长明显减慢，说明体外侵袭能力和体内转移能力可能是相关的表型，而生长与转移能力可能又是相独立的表型。综上所述，GC9811 P 细胞系，符合第二届全国细胞和组织培养专题讨论会通过的建系标准，是一株新建的胃癌腹膜高转移细胞株。肿瘤细胞的体外培养建株难度大，成功率低。由于体外模拟的培养条件与体内实际情况仍有很大差异，体外生存的细胞往往会发生某些生物学特性的改变或丢失。GC9811 P 细胞系的建立及研究结果证明，该细胞系生物学特性稳定，未发生上述改变。为探究人胃癌腹膜转移机理及阻断其转移，提供了理想的细胞模型和裸鼠体内转移模型。【参考
16、文献】1 Kato H, Ishikura H, Kawarada Y, et al. Anti angiogenic treatment for peritoneal dissemination of pancreas adenocarcinoma: a study using TNP 470J. Jpn J Cancer Res，2001, 92(1): 67 73. 2Kaneko K. Yano M, Tsujinaka T, et al. Establishment of a visible peritoneal micrometastatic model from a gastric adenocarcinoma cell line by green fluorescent protein J. Int J Oncol, 2000, 16 (5): 893 898.3白飞虎，郭新宁，杨力，等. 人胃癌裸鼠胃原位移植转移模型的建立J. 第四军医大学学报，2003，24
