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1、1大孔树脂法纯化苦丁茶总黄酮的研究【摘要】 目的确定大孔树脂分离苦丁茶总黄酮的最佳工艺条件。方法以吸附率及解吸率为考察指标，确定最佳型号树脂，静态和动态吸附及解吸的相关影响因素。结果 HP-20 型大孔树脂对苦丁茶总黄酮有良好的吸附，其吸附分离的工艺条件的药液浓度为 1.2 mg/ml，以 3 m1/min 吸附速率进行吸附，2.5 倍柱体积的 70%乙醇洗脱效果最佳。结论该方法简单易行，分离效果好，适于苦丁茶总黄酮的分离纯化。【关键词】 大孔树脂; 纯化; 苦丁茶; 总黄酮Abstract：ObjectiveTo establish the optimum process condition
2、s for purification of flavonoids from Kudincha by macroporous resin. MethodsSeven types of macroporous resin were used to purify flavoniods of Kudincha, and the optimum macroporous resin，relative factors of absorption and desorption for static state and dynamic state were determined with absorption
3、and desorption rate as observation indexes. ResultsThe HP-20 macroporous resin had good absorbing effect on flavonoids of kudincha.The liquid concentration of absorbing and separating technological environment was 1.2mg/ml and the absorbing speed was 3m1/min.The elution effect of 70% alcohol with 2.
4、5 times volume was the best. ConclusionThis method is simple and feasible and fit for separation and punifiation of flavonoids from Kudincha.Key words：Macroporous resins; Purification; Kudincha; Flavonoids苦丁茶中含有大量的黄酮、蒽酮类化合物、生物活性多糖、香豆素类内酯、芳香成分。它具有消炎、扩张冠状动脉、增加冠脉流量、改善微循环、抑菌、抗肝炎病毒、抗肿瘤等功效1，2。大孔吸附树脂是一种具有多
5、孔立体结构人工合成的聚合物吸附剂，是依靠它和被吸附分子之间的范德华力，通过它巨大的比表面积进行吸附而工作的3，4。它具有物理化学稳定性高、吸附选择性好、富集效果好、不受无机物存在的影响、再生简便、解吸条件温和、使用周期长、节省费用等优点，被广泛应用于天然产物的分离纯化5。本文用 7 种不同类型的大孔树脂分离纯化苦2丁茶总黄酮，为苦丁茶的开发利用提供科学的工艺参数。1 材料与试剂苦丁茶，市售，粉碎过 40 目筛，80烘干备用。乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、NaOH 等，均为分析纯;大孔树脂 AB-8，NKA-9，D-100，HP-20，HPD-400，HPD-500，HPD-600(南开大学化工厂)。
6、芦丁对照品，购于中国上海医药化学试剂公司。2 方法2.1 树脂的预处理乙醇浸泡 24 h用乙醇洗至流出液与水(15)不浑浊用水洗至无醇味5%HCl 通过树脂柱，浸泡 24 h水洗至中性2%NaOH 通过树脂柱，浸泡 24 h水洗至中性，备用4，5。2.2 芦丁标准曲线的绘制6回归方程为：A=9.153 6 C-0.004 7(R2=0.999 7)2.3 苦丁茶总黄酮提取物的制备称取苦丁茶粉末 40 g，加 10 倍量 70%乙醇回流提取 3 次，1 h/次，过滤，合并滤液，利用旋转蒸发仪浓缩，然后加蒸馏水充分搅拌溶解过滤，即得样品溶液，备用。2.4 黄酮含量的测定吸取一定量的样液于 25 m
7、l 的容量瓶中，按“2.2”项方法操作，测定并计算总黄酮的含量。2.5 大孔树脂的筛选2.5.1 静态吸附取 7 种处理好的大孔树脂各 10 g，分别加入苦丁茶水溶液 30 ml，开始每 5 min 振摇 1 次，2 h 后静置，6 h 后分别取各树脂吸附后的溶液于 510 3nm 处测定吸光度，计算各种树脂对苦丁茶总黄酮的吸附量和吸附率3。2.5.2 静态解吸静态吸附后的树脂过滤抽干，加 30 ml 70%乙醇解吸，置于摇床上，4 h 后分别取各解吸液 0.2 ml，于 510 nm 处测定吸光度，计算各种树脂对苦丁茶总黄酮的解吸率3。2.6 树脂动态吸附苦丁茶总黄酮的工艺参数考察通过树脂对
8、黄酮的静态吸附试验，对筛选出的一种理想树脂进行上样液的流速，浓度、洗脱剂的浓度以及解吸曲线等工艺参数进行考察。将预处理好的树脂装入玻璃层析柱中，将黄酮提取液上柱，控制一定流速，分步收集(3 ml/管)，当流出液吸光度达上样液的 1/10 时，认为黄酮已透过，停止上样，计算吸附量。 3 结果3.1 大孔树脂的筛选采用静态吸附量、吸附率和解吸率选择树脂。由表 1 可看出，吸附树脂在分离植物有效成分时利用的是吸附的可逆性，由于树脂极性不同，解吸的难易也不同，所以解吸率是筛选树脂的重要因素。HP-20，AB-8 树脂解吸率较高，而 HP-20 树脂的吸附率高于 AB-8 树脂，因此本实验选用 HP-2
9、0 型树脂纯化苦丁茶中的总黄酮。3.2 HP-20 树脂的静态吸附动力学特性测定 HP-20 有较高的吸附率和解吸率，因此选择 HP-20 树脂进行静态吸附动力学曲线。由图 1 可知，HP-20 树脂对苦丁茶总黄酮的吸附为快速平衡型，即在起始阶段吸附量比较大，在 5 h 内基本接近达到平衡。HP-20 树脂对苦丁茶总黄酮具有良好的静态吸附动力学特性，较适宜于苦丁茶总黄酮纯化。表 1 大孔树脂静态吸附率与解吸率3.3 树脂动态吸附苦丁茶总黄酮的工艺参数考察43.3.1 上样流速的确定上样流速是影响树脂吸附性能的重要因素之一。将上样流速分别控制为 1，2，3，4，5 ml/min 进行动态吸附，流
10、速对吸附量的影响(见图 2)。由图 2 可以看出，当流速超过 3 ml/min 时，树脂的吸附量明显下降。因此上样流速为 3 ml/min 为宜。图 2 上样流速对吸附量的影响3.3.2 上样液浓度的确定将苦丁茶总黄酮提取液加水稀释成不同浓度的上样液，进行动态吸附实验。(见图 3)。在低浓度下，随着黄酮浓度增加，树脂吸附率增大;在黄酮浓度为 1.2 mg/ml 时，树脂具有最大吸附率;而黄酮浓度大于 1.2 mg/ml后，树脂吸附率反而下降，因此上样液浓度为 1.2 mg/ml 为佳。图 3 上样液浓度对吸附率的影响3.3.3 洗脱剂浓度的确定由于乙醇毒性低，易浓缩回收，适于用作洗脱剂。本实验
11、分别选择了不同浓度的乙醇水溶液作为洗脱剂，考察其解吸率(见图 4)。70%以上的乙醇水溶液解吸效果最好解吸率达 88.5%，因为乙醇的浓度不同，其极性大小也不同，70 %乙醇的解吸率较高可能是由于其极性和苦丁茶总黄酮的极性更加接近。因此，实验确定选择 70 %的乙醇作为解吸剂。图 4 洗脱剂浓度对解吸率的影响3.3.4 HP-20 动态解吸由图 5 可以看出，采用体积分数 70%乙醇进行解吸，洗脱峰集中，较对称，没有明显的拖尾现象。72 ml 的体积分数为 70%的乙醇，基本上可以将黄酮完全洗脱下来，经计算解吸率达 90.04%。5图 5 解吸曲线4 结论通过测定 7 种大孔树脂对苦丁茶总黄酮
12、的吸附特征，确定 HP-20 为最佳的吸附剂，它不仅具有吸附快、解吸率高等特点，而且具有吸附容量较大，洗脱率高，树脂再生简单等优点，在苦丁茶富集总黄酮工艺中具有一定的应用价值。采用HP-20 大孔树脂进行苦丁茶总黄酮分离纯化 5 h，收集精制液，60下旋转蒸发，浓缩液在 60下真空干燥，测定经树脂纯化后中黄酮纯度达到 42.8%(粗提物中黄酮纯度为 8.28%)。【参考文献】1 姚晓敏, 孙向军,张 英.苦丁茶资源的综合利用J.应用技术市场,2000,11:2.2 毛莉娟,刘学文,冉 旭.苦丁茶中黄酮的提取工艺J.食品科技,2002,11:18.3 金 莹, 孙爱东.大孔树脂纯化苹果多酚的研究J.食品科学,2007,28(4):160.4 冯 颖, 王建国,孟宪军,等.大孔树脂纯化无梗五加果总黄酮工艺研究J.安徽农业科学,2006,34(10):2169.5 盛 萍, 帕丽达阿不力孜, 刘 波，等.大孔树脂吸附法富集野菊花总黄酮的工艺研究J.中草药,2006,37(8):170.6 黄林芳,万德光.川产苦丁茶中总黄酮的含量测定J.时珍国医国药,2004,15(6):327.
