《白腐菌漆酶基因的克隆及序列分析》由会员分享，可在线阅读，更多相关《白腐菌漆酶基因的克隆及序列分析（79页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、摘要漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，普遍存在于白腐菌中，具有降解木质素和使苯氧基类除草剂等有毒酚类物质无毒化的作用，还可去除石油工业废水的毒性。在造纸、饮料加工、和环保等方面具有广泛的应用自H 景。大多数白瘸菌在水中的生长速度较馒，结球结块，仅能生活在水体表面，这些都限制了其在处理废水等方面的直接应用。克隆自腐菌漆酶的结构基因，对今后培育白腐菌漆酶基因大量表达的工程菌株和用工程菌处理酚类污染的废水等具有十分重要的意义。本研究以2 5 种自腐真菌为材料，测定了不同菌株漆酶的活性，并对6 种自腐菌漆酶基因进行了克隆和序列分析，结果如下；( I ) 对2 5 种白腐真菌进行了漆酶活性铡定，结果有11 个
2、菌种具漆酶活性，它们分别是裂蹄木层孔菌( P h e i n u s i n t e u s ) 、朱红密孔菌( P y c n o p o r u sc i n n a b a r i n u s ) 、环带干酪菌( T v r o 墨Y c e sz o n a t u l u s ) 、栎迷孔菌( O a e d a l e aq u e r c i n a ) 、三色革裥菌( L e n z i t e st r i c d o r ) 、北方梭囊孔菌( 口i m a c o c y s t i s b o r e a l i s ) 、桦革裥菌( L e n z i P s 5 e
3、t u i n a ) 、血红密孔菌( P v c n o p o r u s s a n g u i n e u s ) 、自粑齿菌( I r p e x l a c t e a ) 、单色下皮黑( 国r 阳月au n i c o i o r ) 、梭孔菌( F a v o i u sa J v e o 龇拈) 。( 2 ) 建立了快速提取高纯度完整丝状真菌R N A 、D N A 的方法。( 3 ) 通过R T P C R 实验证明了扁芝菌的m R N A 不具有P o l y ( A ) 序列。( 4 ) 设计并合成了用于克隆漆酶基因的一对简并引物，在6 个菌种中扩增和克隆了与漆酶基因及
4、其类似基因有同源性的特异片段，它们分别是朱红密孔菌( 1 2 2 7b p ) 、血红密孔菌( 1 2 2 7b D ，A Y 3 3 1 1 8 9 ) 、单色下皮黑( 1 2 0 7b p ，A Y 4 5 4 3 0 5 ) 、环带干酪菌( 1 2 2 3b p tA Y 4 5 4 3 0 6 ) 、北方梭囊孔菌( 1 2 0 1b p ，A Y 3 3 3 1 2 4 ) 、枥迷孔菌 、r y r o m y c e s2 0 n a l t d u sti 2 2 3b p A Y 4 5 4 3 0 6 ) 、C i m a c o c y s t i sb o r e a l
5、i s ( 1 2 0 1b p ，A Y 3 3 3 2 4 ) 、D a e d a e aq u e r c i n a ( 1 2 3 2b p ，A Y 3 3 3 1 2 5 )( 5 ) T h ef u l l 1 e t I g 小e D N Ao fP y c n o p o r u ss a n g u i n e u sI n c e n s eg e n eW a sc l o n e d A c c o r d i n gt ot h eI n c e n s eg e n ef r a g m e n to fP y c n o p o r u ss a n g
6、u i n e u s ( A Y 3 3It8 9 ) ，T h ef u l l l e n g t he D N Ao fP y c n o p o r u ss a n g u i n e u 3l a c c a s eg e n ew a si s o l a t e db yu s i n gR A C E ( r a p i da m p l i f i c a t i o no fe D N Ae n d s ) t e c h n i q u e ，1 h e 魁l ll e n g c l lo fs e q u e n c ew a s19 0 2b p ，c o m
7、a i n i n ga l lo p e nr e a d i n gf r a m e ( 1 5 5 4b p ) e n c o d i n gap e p d d eo f 5 1 8a l l l i l l oa c i d s 5 a n W a n s l a t e dr e 9 4 0 nW a s5 j 印，3 。u n t r a n s l a t e dr e g i o nw a s2 9 7b p B L A S Ta n a l y s i sr e v e a l e dt h a tt h el a c c a s ec D N Aa n d 锄曲oa
8、c i d ss e q u e n c ef r o mP y c n o p o r u ss a n g u i n e u ss h a r e dh i g hi d e n t i t yw i t hl a c c a s eg e n ef r o mo t h e ro r g a n i s m si nn u c l e o t i d e sa n da n l m oa c i d sr e s p e c t i v e l y , T h el a c c a s ep r o t e i nh a sf o u rc a t a l y t i cc u p r
9、 i c1 0 1 1 5d o m a i na n ds e v e ng t y c o s y l a t i o ns i t e s ，t h er e l a t i v em o l e c u l a rw e i g h tw a s5 6 3i32 ，a n dt h e o r e t i c a lp Jw 酷5 , 5 9 【6 ) T h ec o m p l e t eD N As e q u e n c eo fl a c c a s ef r o mP y c n o p o r u ss a n g u i n e u sw a so b t a i n
10、e d B a s e do nt h eP y c n o p o r u ss a n g u i n e u sl a c c a s ec D N As e q u e n c e ，ap a i ro f s p e c i f i cp d m e rh a db e e nd e s i g n e d ；t h ec o m p l e t eD N As e q u e n c eo f 2 1 5 4b p ( A Y 5 1 0 6 0 4 ) W a Si s o l a t e db yP C R B e s i d e st h ec o d i n ga r e
11、ao fc D N A ，t h es e q u e n c ec o n t a i n i n g1 0i n t r o n sr e g i o n s ，w i t hl e n g t hb e t w e e n5 2 7 0b p ，w h i c hs h o w e dt y p i c a le u k a r y o t e si n t r o nc h a r a c t e r i s t i c ，i n c l u d i n g57d o n o rs p l i c i n gs i t e 、3 r e c e p t o rs p l i c i n
12、 gs i t ea n db i f i a r c a t es e q u e n c e K e yw o r d s ：l a c c a s e ，w h i t e r o tf u n g i ，P y c n o p o r u ss a n g u i n e u ，g e n ec l o n i n g ，R A C E白腐菌漆酶基因的克隆及序列分析1 前言I 1 漆酶的研究概况漆酶是一种多酚氧化酶( D - d i p h e n 0 1 _ o x i d a s eE C L 1 0 3 2 ) ，它最早是R 本学者吉f = f = |从漆树的分泌物中发现( Y
13、o s h i d a ，1 8 8 3 ) ，随后人们发现一些高等真菌也能分泌这种酶( B e r t r a n d ，1 9 8 7 ：L a b o r e d ，1 8 9 6 ) 。现在人们知道，漆酶广泛存在于担子菌、半知菌和子囊菌中，但其中最主要的生产者是担子菌中的白腐菌。也发现几种昆虫( T h o m a sP fa ，1 9 8 9 ) 、细菌( A l e x a n d r e Z h u li n ，2 0 0 0 ：S a n c h e z A m a teEa 7 ，2 0 0 1 ：M a r t i n se ta ，2 0 0 2 )及最近发现黄蜂的毒液(
14、 P a r k i n s o ne ta J ，2 0 0 1 ) 均能分泌漆酶。1 0 0 多年来，漆酶一直是生物学、化学和环境科学等领域十分活跃的研究热点，其中最受重视的是溱酶在本质素降解中的重要效用。近年来随着研究的深入，漆酶对与木质素自口体物质分子结构相似的许多环境污染物的降解作用受到人们的关注( , 8 u m p u se t “，1 9 8 5 ) ，尤其在纸浆生物漂白、废水处理、坏境污染物质去毒与降解方面，显示出具有较大研究价值和应用潜力，并己耿得些突破性成果和显著成就。随着2 0 世纪7 0 年代前后聚丙烯酰胺凝胶电泳和分子克隆等生物学技术的问世，漆酶分子生物学的研究也揭
15、开了新的一页。在国外很多菌种的漆酶基因得到了克隆并且进行了分析和鉴定，一些漆酶基因也实现了其异源表达。漆酶首先从木质索降解研究中发现，并在木质素降解中超重要作用。本文就漆酶、漆酶分子生物学以及基因克隆研究进展方面进行了评述。1 1 1 漆酶的理化性质1 1 1 1 产漆酶的微生物漆酶最初是在漆树漆液中发现的，随后人们发现某些高等真菌也能分泌这种酶。多年柬的研究发现，漆酶在植物中具有广泛的存在，而在微生物世界的分布范围则是有限的。漆酶主要存在于担子菌中的一个特殊类群一白腐菌中，在部分半知菌中有少量的分御，在原核生物中则极为罕见。严东辉，杨宝军( 1 9 9 7 ) 还发现松材线虫B u r s
16、a p h e T e n c h u sx y l o p h i l u s也能向体外分泌漆酶和过氧化物酶。1 1 1 2 漆酶的活性测定方法测定漆酶活性的方法有H P L C 法、测压法、分光光度法、级谱法等。目前常以3 - 乙基苯东北林业大学硕士学位论文并噻唑一6 磺酸( A B T s ) 为底物，测定漆酶对其氧化速度。具体方法为：反应在2 5 下进行，总反应体积3m L 中，含有2 【1 3 L 溶有0 ，5 m o l A B T g 的0 。1m m o l L 醋酸缓冲液( P H = 50 ) ，添加酶液启动反应，在4 2 0n m 下测定其吸收值的变化。酶活力单位定义为上述条件下( 2 5 ，p Hj o ) lf f l L 酶液每m i n 氧化底物( A B T S ) 引起吸光值的增加量( A O D 。( m L m i n ) ) ( 缪静，姜竹茂，2 0 0 1 ) 。C f e m m a rJD ( 1 9 9 7 j 等以二
