热原和细菌内毒素

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1、热原热原 pyrogen 热原系指由微生物产生的能引起恒温动物体温异常升高的致热物质。它包括细菌性热原、内源性高分子热原、内源性低分子热原及化学热原等。这里所指的“热原”，主要是指细菌性热原，是某些细菌的代谢产物、细菌尸体及内毒素。致热能力最强的是革兰氏阴性杆菌的产物，其次是革兰阳性杆菌类，革兰阳性球菌则较弱，霉菌、酵母菌、甚至病毒也能产生热原。 热原通常是磷脂多醇与蛋白质结合而成的复合物。磷脂多醇是复合物的活性中心，致热作用最强。其化学组成因菌种不同而有所差异。分子量为 51045105，分子量越大致热作用也越强。 系能够致热的微生物的尸体及其代谢产物，即细菌的一种内毒素。细菌、霉菌、病毒均

2、可产生热原。热原最主要特性为耐热性，其为由磷脂、脂多糖和蛋白质所组成的复合物，存在于细菌的细胞和固体膜之间。脂多糖是内毒素的主要成分，具很强的热原活性。热原分子量为 10105 左右。热原具耐热性、滤过性、水溶性、不挥发性。当热原被输入人体后，约 0.5h 后，使人发冷寒战、高热、出汗、恶心、呕吐、昏迷甚至危及生命，可于注射剂灭菌时根据其特性彻底破坏热原。 注入人体的注射剂中含有热原量达 1g/kg 就可引起不良反应，发热反应通常在 注入 1 小时后出现，可使人体产生发冷、寒颤、发热、出汗、恶心、呕吐等症状，有时体温可升至 40以上，严重者甚至昏迷、虚脱，如不及时抢救，可危及生命。该 现象称为

3、“热原反应热原反应”。 热原引起机体发热机理热原引起机体发热机理 热原白细胞吞噬白细胞崩解，释放内源性致热源作用与体温调节中枢产热增加，散热减少体温上升 细菌内毒素细菌内毒素 细菌内毒素，英文称作 Endotoxin，是 G-菌细胞壁个层上的特有结构，内毒素为外源性致热原，它可激活中性粒细胞等，使之释放出一种内源性热原质，作用于体温调节中枢引起发热。细菌内毒素的主要化学成分为脂多糖。. 细菌内毒素这个概念在 1890 年的时候就已被提了出来，它是在研究发热物质过程所引起的，1933 年 Boivin 最先由小鼠伤寒杆菌提取出来，进行化学免疫学方面的研究，到 1940 年时候，Morgan 使用

4、志贺氏痢疾菌阐明了细菌内毒素是由多糖脂质及蛋白质三部分所组成的复合体，到了 1950 年以后，随着生物学，物理化学，免疫学以及遗传学等的进步发展，细菌内毒素的研究工作，尤其是其化学结构组成及各种生物活性间的关系也更加明确起来。 细菌英文叫 Bacteria：为原核生物中的一类单细胞微生物由二分裂法繁殖。若按革兰氏染色法可将细菌分为 G+菌和 G-菌两大类。这两类细菌细胞壁的结构和化学组成存在很大差异。 唯有肽聚糖为其共同成分， 但其含量的多少和肽链的性质有所不同，见上图表 细胞壁较薄，厚约 1015nm，结构也较复杂。肽聚糖含量低，仅占细胞干生 10左右，层薄又较疏松，因肽聚糖之间仅四肽侧链直

5、接联结，缺乏五肽桥；肽聚糖居于细胞最内层，外面由内向外还有脂蛋白，外膜和脂多糖的三层聚合物。 （1）脂蛋白（lipoprotein） 由类脂和蛋白质构成，联结在外膜与肽聚糖层之间，类脂一端经非共价键联结到外膜的磷脂上， 另一端由共价键联结到肽聚糖肽链中的二氧基庚二酸 残基上，使外膜和肽聚糖层构成一个整体。 （2）外膜（outer membrane） 是革兰氏阴性菌细胞壁的重要结构，位于肽聚糖的外侧，其结构类似细胞膜，为液态的磷脂双层，其中镶嵌一些特异蛋白质，穿透外膜的内外双层，呈液态镶嵌体。外膜中间有微小孔道，容许水溶性的小分子通过，以进行细胞内外的物质运输和交换。除此之外，外膜还能防止胰蛋白

6、酶和溶菌酶等进入，起到保护性屏障作用。 （3）脂多糖（lipopolysaccharide,LPS） 由多糖 O 抗原、核心多糖和类脂 A(lipid A)组成（图 1-8），位于最外层。多糖 O 抗原向外，由若干个低聚糖的重复单位组成的多糖链，即革兰氏阴性菌的菌体抗原（O 抗原），有特异性。核心多糖由庚糖、半乳糖、2-酮基-3-脱氧辛酸（2-keto-3-deoxyoctonic acid, KDO）等组成，所有革兰氏阴性细菌都有此结构。类脂 A 是以脂化的葡萄胺二糖为单位，通过焦磷酸酯键组成的一种独特的糖脂化合物，具有致热作用，是革兰氏阴性细菌内毒素的毒性成分。 细菌内毒素即：许多病原性细

7、菌所产生的毒素。 一般细菌毒素可分为两类，一类为外毒素（Exotoxin）；它是一种毒性蛋白质，是细菌在生长过程中分泌到菌体外的毒性物质。 产生外毒素的细菌主要是革兰氏阳性菌。如白喉杆菌、破伤风杆菌、肉毒杆菌、金黄色葡萄球菌以及少数革兰氏阴性菌。另一类为内毒素（Endotoxin）。是革兰氏阴性菌的细胞壁的产物。细菌在生活状态时不释放出来，只有当细菌死亡自溶或粘附在其它细胞时，才表现其毒性，内毒素的主要化学成分是脂多糖中的类脂 A 成分。 细菌内毒素的生物活性：细菌内毒素的生物活性： 1、致热性。2、致死性毒性。 3、白细胞减少。4、Shwartzman 反应。5、降低血压，休克 6、激活凝血

8、系统。7、诱导对内毒素的耐受性。8、鲎细胞溶解物（鲎试剂）的凝集。9、刺激淋巴细胞有丝分裂。10、诱导抗感染的特异性抵抗力。11、肿瘤细胞坏死作用。 细菌内毒素的量值（单位）细菌内毒素的量值（单位） 在 80 年代以前，所有研究内毒素的报道，毫无例外地使用重量单位表示内毒素的量，在鲎试剂鲎试剂建立后也同样以重量单位表示鲎试验的灵敏度。随着人们对细菌内毒素生物活性认识的提高，以重量单位表示的不科学性被揭示，即相同重量的内毒素，以重量单位表示的不科学性被揭示，即相同重量的内毒素，对 于菌种来源不同，其生物活性相差很大。对 于菌种来源不同，其生物活性相差很大。1980 年美国学者 Hochstein

9、 完成了将重量单位转化为内毒素单位的工作。当时美国内毒素参考标准品代号为 EC-2，该品的家兔发热剂量 ED50 为 1.04ng/kg，而与此同时美国食品药品管理局（FDA）批准的鲎试剂参考品为第四批， FDA 邀请当时已获有鲎试剂生产许可证的制造商进行协作研究，采用 EC-2 与第四批鲎试剂参考品，求出两者的凝聚终点用 ng/ml 表示，四个实验室的 56 次单独试验结果，几何平均值为 0.194ng/ml，FDA 就此规定该值为 EC-2的 1 个内毒素单位，EC-2 的量值为 5EU/ng。自 1982 年美国药典修订 1980 年（20）版首次收载的细菌内毒素试验，内毒素单位（内毒素

10、单位（EU）被正式引入，明确指出美国内毒素参考标准品每瓶含 10000EU。 细菌内毒素的检测 细菌内毒素是革兰氏阴性菌的细胞壁成分， 当细菌死亡或自溶后便会释放出内毒素。因此，细菌内毒素广泛存在于自然界中。如自来水中含内毒素的量为 1 至 100EU/ml。当内毒素通过消化道进入人体时并不产生危害，但内毒素通过注射等方式进入血液时则会引起不同的疾病。内毒素小量入血后被肝脏枯否细胞灭活，不造成机体损害。内毒素大量进入血液就会引起发热反应“热原反应”。因此，生物制品类、注射用药剂、化学药品类、放射性药物、抗生素类、疫苗类、透析液等制剂以及医疗器材类（如一次性注射器，植入性生物材料）必须经过细菌内

11、毒素检测试验合格后才能使用。由于家兔对热原的反应与人基本相似，所以半个世纪以来用家兔来检测热原，为保障药品质量和用药安全发挥了重要作用。 1956 年美国人 Bang 发现美洲鲎血液遇革兰氏阴性菌时会产生凝胶。其后 Levin 和 Bang 又搞清楚微量革兰氏阴性菌内毒素也可以引起凝胶反应，从而创立了鲎试剂检测法。由于鲎试剂法简单快速灵敏准确，目前已广泛用于临床、制药工业药品检验等方面。 在美国，鲎试验被称作为“细菌内毒素试验（Bacterial Endotoxin Test）收载于1980 年 20 版美国药典。随后英、德、意、日以及中国相继在药典中收载了这一检查法。此后鲎试验逐渐替代家兔热

12、原试验，但由于部分药品由于自身特殊性无法通过稀释法消除干扰， 因此鲎试验还无法完全取代家兔热原试验。2005 年版中国药典规定 168 个品种进行细菌内毒素检查法，并收录了 2 种细菌内毒素检查法：包括凝胶法和光度测定法两种方法。 前者利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的原理来定性检测或半定量内毒素，后者包括浊度法和显色基质（比色）法，系分别利用鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度变化及产生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少来定量测定内毒素。比色法又可分为终点显（比）色法和动态比色法。该方法灵敏度、精密度高。国内如厦门鲎试剂厂早在 05 年即有显色基质（终点显色）鲎试剂盒上市。 热原是一种致热物质

13、，有两种来源，一种是来自生产环境的污染程度，即产品的初始污染菌，这种致热原可用细菌内毒素的方法检测出来；而另一种致热原则来自于材料， 材料对人体的致热程度是无法用细菌内毒素的方法检测出来的，必须用家兔法进行检查。所以，你的产品如果是首次注册，材料中的致热程度还不明确的时候，不能只检测细菌内毒素，也需要用家兔法检测热原。如果你的产品重新注册，材料中的致热原已经被排除，那么只需检测细菌内毒素就可以了。个人观点，供参考。 11 热原的本质 M.Thmas 等1指出，热原（Pyrogen）又称内毒素（Endotoxin）,产生于革蓝氏阴性（Gram-nagative）细菌的细胞外璧，亦即细菌尸体的碎片

14、。它是一种脂多糖物质（Lipopoly-saccharide） ，简称 LPS，其相对分子质量从几千到几十万不等，根据产生它的细菌种类而定。在水溶液中，其相对分子质量可为几十万到几百万不等。最近已揭示了类脂 A（Lipid）也是热原物质，构成为危害人体的内毒素，相对分子质量大约为 2000。 永田彦等指出2，发热性物质即热原有两类：一类是低相对分子质量发热物质（Pyretice） ，另一类是高相对分子质量发热物质（Pyrogen） ，它们统称为内毒素。一般认为热原是指细菌发热物质，它由革蓝氏阴性细菌的细胞壁的外膜构成。更进一步分析其主要成份是脂多糖（LPS）及类脂 A，是热原的活性部分。它们的

15、相对分子质量一般为 1 万2.5 万，在水溶液中形成缔合体，相对分子质量可达 50 万100 万。这类物质具有耐热性和化学稳定性，不易被除灭。 12 热原的定量表示 热原可以用浓度来定量标度。文献大都以每毫升克数为浓度单位，一般单位为 ng/ml，即 10-9g/ml，或 pg/ml，即 10-12g/ml。也有采用 EU/ml为热原单位。我国 1998 年药典确定用EU/ml为热原单位。两个单位之间的换算关系比较复杂，因为来自不同种类细菌的热原毒性表现不尽一致。美国有关部门对大量试样数据采用概率统计方法提出如下结果：对 EC2 类细菌 1ng/ml5EU/ml；类细菌 1ng/ml10EU/

16、ml。日本药检部门报告对 EKT 类细菌 1ng/ml8EU/ml。 13 热原的测定方法 热原的分析、测定方法主要有鲎试剂法和家兔法。 131 鲎试剂凝胶法 该法是利用鲎试剂检测供试品中或其表面可能存在的细菌内毒素浓度的一种方法3。目前，各国药典收载的细菌内毒素试验法均包含凝胶法。 药品细菌内毒素检查是以凝胶法为基础， 通过试验证明供试品某一浓度对凝胶法不存在干扰作用后， 在供试品的有效浓度范围内， 根据供试品的内毒素限值进行检测的一种方法4。此法厦门鲎试剂实验厂的吴伟洪先生已经有近三十年的研究，先后出版了四期的【鲎试剂研究进展】 ，近些年又推出了显色基质鲎试剂检测后，实现定性到定量的飞跃，为内毒素检测的新方法。 132 家兔法 该法则为各国药典中规定的标准检测方法，可简述为取 3 只健康家兔各注入规定量的试样，在一天内单兔体温上升不超过 0.6，3 兔总升温不超过 1.4，即被认为试验中热原含量合格。