《肾上腺髓质素对大鼠脑缺血再灌注神经元的作用及机制》由会员分享，可在线阅读，更多相关《肾上腺髓质素对大鼠脑缺血再灌注神经元的作用及机制（64页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、肾上腺髓质素对大鼠脑缺血再灌注 神经元的作用及机制目的肾上腺髓质素( A D M ) 是由5 2 个氨基酸组成的血管活性多肽，属于降钙素基因相关肽( c G R P ) 家族，与多种组织的缺血再灌注损伤有关。有学者证实在中枢神经系统有A D M 的表达，并与脑缺血再灌注损伤有一定关系。也有持相反意见的研究报道。所以我们选用大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，应用免疫组织化学方法、原位杂交组织化学法、逆转录一聚合酶链式 ( R T P C R ) 分析方法等，验证正常大鼠脑组织是否有A D M 及A D Mm R N A的表达及具体表达的部位；观察A D M 及A D Mm R N A 在局灶性缺血再灌
2、注大鼠脑组织中的表达变化规律；探讨A D M 对局灶性缺血再灌注大鼠神经元凋亡、梗死体积及E 黟一1m R N A 的影响，进一步研究A D M 在局灶性缺血再灌注脑损伤中的作用方法健康雄性s D 大鼠1 8 6 只，体重2 0 0 2 5 0 9 ，由中国医科大学实验动物中心提供。随机分为正常组( n = 1 2 ) ，假手术组( n = 1 2 ) ，局灶性脑缺血2 h再灌注2 h 组( n = 1 8 ) 、4 h 组( n = 1 8 ) 、2 2 h 组( n = 5 4 ) 、4 6 h 组( n = 1 8 ) 、7 0 h组( n = 1 8 ) 、1 1 8 h 组( n =
3、 1 8 ) 、1 6 6 h 组( n = 1 8 ) 。其中再灌注2 2 h 组又分为：股静脉注射A D M 组( n = 1 2 ) ，颈内动脉注射A D M 组( = 1 2 ) ，侧脑室注射A D M 组( n = 1 2 ) 。采用线栓法制成大鼠大脑中动脉缺血再灌注( M C A 0 ) 模型，阻断血流2 h 进行再灌注。缺血再灌注各组大鼠在缺血2 h 再灌注4 h时，参考B e d e r s o n 等的5 分制评分标准对其进行神经功能缺损评分，评分后分别制备石蜡切片和冰冻切片，T T c 染色测定梗死体积，H E 染色光镜下观察大鼠大脑皮质、海马的组织学变化，T u N E
4、L 法检测神经元凋亡，免疫组织化学法( S A B C 法) 检测A D M 阳性细胞表达，原位杂交法检测A D M 蹦州A1 及E F lm R N A 阳性细胞表达，R T P C R 法检测A D Mm R N A 在大鼠局灶性脑缺血再灌注前后的表达。原位杂交针对A D M 的多相寡核苷酸探针序列为：57 1 G G G TT C A C TC G C T l T C C T AG G C G CG G A C A 一3 ；5 一A G A A G T G G A A T A A G TG G G C GC T A A GT CG ，I G 一3 ：5 一C G T G TC A A A
5、 CG C I A CC G C C AG A G C AT C A A C 一37 。针对E F l 的多相寡核苷酸探针序列为：5 一G A G G AG A T G A I G C T GC T G A GC A A C GG G G C T 一3 ：5 一G C C T TT G C C AC T C A GT C G G GC T C C CA G G - A C 一3 ：5 一C C 7 I f I TT C T C CC A G G AC A A T TG A A A Tr I - r G c T 一3 。R T P c R 针对大鼠A D M 前体正义引物为：5 一c C GA
6、c AG A CA A CA G AC G C 一3 ，反义引物为：5 一C A CC c TG A GG C AG A TG A A 一3 ，扩增产物2 7 8 b p ；以S a c t i n 为内参照，其正义引物为：5 一G A TT G CC T CA G GA C AT T TC T G 一3 ，反义弓l 物为5 一G A TT G C T C AG G AC A Tr r r CT G 一37 ，扩增产物6 9 0 b p 。取扩增产物7 一电泳，经溴酚蓝染色后用B i 0 2 R A DG e lD o c2 0 0 0 型影像分析系统检测并计算出各组A D Mm R N A
7、电泳条带与内参照B a c t i n 条带的表达量像素灰度的比值。结果在正常大鼠大脑内有A D M 及A D Mm R N A 的表达，主要表达在大脑皮质锥体细胞、海马C A l 区、C A 2 区、C A 3 区、C A 4 区锥体细胞、齿状回颗粒细胞层、丘脑的室旁核、视上核、丘脑内侧核、丘脑外侧核、缰内侧核、室旁组织、脉络丛、室管膜细胞、尾状核、壳核、苍白球、血管内皮细胞及平滑肌细胞，其中室旁组织为高表达区。缺血再灌注各组大鼠在缺血再灌注后均出现不同程度的神经功能损伤，其神经功能损伤评分显著高于假手术组，p o 0 5 。缺血再灌注组大鼠缺血侧大脑皮质、海马c A l 区T u N E
8、L染色阳性细胞明显多于假手术组，P O 0 5 。3H E 染色结果：正常对照组大鼠大脑皮质和海马C A l 区细胞层次分明，形态结构正常。缺血再灌注组缺血侧额顶叶大脑皮质、海马神经元减少，排列紊乱，细胞周围间隙增宽，有大量坏死神经元，胞体肿胀，胞浆淡染，胞核溶解，结构不清，可见大量固缩神经元。( 图l A H )4 免疫组化结果：免疫组化结果显示：正常对照组及假手术组有A D M 阳性细胞表达，但两者相比未见明显差异，P O 0 l 。大鼠脑缺血再灌注后大脑皮质( 图2 AI ) 、海马( 图3A F ) A D M 阳性细胞表达高于正常组大鼠P 0 。0 l ( 图4A F ) 。我们还发
9、现，大鼠缺血再灌注缺血侧大脑皮质A D M 阳性表达的锥体细胞层次分明、形态结构正常，而A D M 阴性表达的锥体细胞形态结构异常，损伤明显。随再灌注时间延长，脑血管内皮细胞A D M 表达逐渐增加。表各组大鼠A D M 免疫组化结果( A D M 阳性细胞平均灰度值的比较叉s组别大脑皮质海马正常对照组( n = 6 )1 8 4 6 5 1 2 8 6假手术组( n = 6 )1 6 5 5 6 8 3 2 缺血2 h 再灌注不同时间2 h ( n = 6 )4 h ( n = 6 )2 2 h ( n = 6 )4 6 h ( n = 6 )7 0 h ( n = 6 )1 1 8 h (
10、 n = 6 )1 6 6 h ( n = 6 )1 4 7 8 5 6 0 4 1 4 5 9 5 1 1 0 3 1 3 4 1 3 5 1 0 1 4 5 1 4 1 0 5 7 1 4 5 4 1 1 0 0 2 1 4 7 9 6 8 5 3 1 4 8 “7 0 4 + 1 7 0 3 4 9 5 31 6 0 2 4 7 1 9 。1 4 0 3 5 7 2 l 蒯1 3 0 0 3 6 5 0 1 4 1 6 7 6 5 6 蝌1 4 0 ：3 4 6 6 5 鼎1 4 1 3 4 1 3 1 l “1 4 1 8 5 7 7 8 # #1 4 0 7 3 1 4 2 3 群注
11、：与正常对照比较，P O o l ；”与假手术组比较，P 0 0 5 。缺血2 h 再灌注4 h 组与再灌注2 h 、2 2 h 、4 6 h 、7 0 h 、1 1 8 h 、1 6 6 h 组相比P O 0 5 。2 5 图1 局灶性缺血再灌注前后大鼠脑组织H E 染色F 唔1 C o m p a r i s o no fH Es t a i n i n gb e f o r ea n da f t e rf o c a lA 正常大脑皮质( l ) N o 唧a lc e r e b 髓Ic o r t e “1 0 0 )i s c h e m i “n p e r f u s i o
12、 ni nr a t 8卜正常大脑皮质( 枷)N o n n a lc c r e b r a lc o n e “X 4 0 0 )卜正常海马c A l ( 4 0 0 )E 局灶性缺血再灌注后大脑皮 N o 皿a Ih i p p o c 叠m p 皿sC A l ( 4 0 0 ) 质( l 帅)C e r e b r a lc o r 缸堰丑f t e rf b c a li h e 塑i I ，r e p e r f u s i o n ( 1 0 0 )G 一一局灶性缺血再灌注后海马C A l ( 1 0 0 )H i p 】即n m p u 5c A l叠l t 盯f 0 龆l
13、i s c h 蛔惭r f n 3 l ( 1 呻)H 局灶性缺血再灌注后海 马C A l ( 帅O )H i p p o 龃m p 5C A lI f I e rf 0 蛆lb c h e m i | ，糟p e 巾l s i 日哦( 柏0 )- 2 6 C 正常海马C A l ( 1 0 0 )N o r m a I h i p p o c a m p u 3C A l ( 1 0 0 )F 局灶性缺血再灌注后大脑皮质( 4 0 0 )C e r e b r a lc o r t e xa n e rf b c a li s c b e m j 4 ，m p e r f u s i o n
14、 ( 柏0 )图2 大鼠局灶性缺血再灌注后不同时间大脑皮质A D M 阳性细胞表达情况( 免 疫组织化学染色)F i g2 T h e 唧r e s s i 佃o f A D Mp o s i t i r ei m m u n o c y t e si c e r e b r a lc o r t e xa ld i 行b 代n t i m e sa f t e rf o c a li s c h e m i “r e p e r f n s i o ni nr a t s ( i m m u n o h i s t o c h e m i s t r ys t a i n i B g ) 缺
15、血Z h 再赣注Z h ( x t )工s c b 哪j a2 h ，r 印e r r u s i D n2 h ( ) ( 1 0 0 )沪秧血2 h 再灌注2 h ( I s c h 咖i a2 h ，r e p e r 如s i o n2 h O 0 5 。动态观察发现，窿映血2 h 再灌注2 h 后，大脑皮质A D Mm R N A 即开始表达，缺也舶荐灌注4 h 达寿蜂，再灌注2 2 A 已明显下降，但仍高于正常对照纽及假手术组，P 0 0 5 。2A D M 对细胞凋亡的影响：T u N E L 结果显示：假手术组大鼠大脑皮质、海马组织仅见极少量T u N E L 阳性细胞，缺血再
16、灌注组大脑皮质、海马c A l区T u N E L 阳性细胞明显多于假手术组，P 0 0 5 。4 大鼠局灶性脑缺血再灌注前后E g r l 脚R N A 表达情况及A D M 对其影响：E 蓼一lm R N A 在假手术组为轻度表达，主要为细胞核着色。阳性细胞成灶性或散在分布。缺血再灌注后大脑皮质、海马E 黟一1m R N A 过表达，除细胞核着色增强外，胞质亦着色，呈颗粒状的棕褐色着色。注射A D M后三组大鼠大脑皮质、海马E g r 一1m R N A 的过表达迸一步增强，胞质着色更加明显，尤以颈动脉注射A D M 组和侧脑室注射A D M 组E 铲一1m R N A 过表达增强最明显( 图3A E )
