不同亲和色谱纯化抗体的比较

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1、本文节选自 GE Healthcare BioProcess Newsletter2009 年第三期的抗体生产纯化，综合介绍了 Protein A Sepharose、Protein G Sepharose、MabSelect、MabSelect Xtra、Mabselect Sure 等多种亲和层析介质的特点和应用。作者：苗景赟 孙文改 通用电气（中国）医疗集团1 Protein A Sepharose 、rProtein A Sepharose 亲和层析介质与抗体的结合目前，约 70-80%的抗体纯化使用 Protein A、Protein G 亲和层析。蛋白 A (Protein A)

2、来源于金黄色葡萄球菌的一个株系，它含有 5 个可以和抗体 IgG 分子的 Fc 段特异性结合的结构域。蛋白 A 作为亲和配基被偶联到琼脂糖基质上，可以特异性的和样品中的抗体分子结合，而使其他杂蛋白流穿，具有极高的选择性，一步亲和层析就可达到超过 95%的纯度。1 个蛋白 A 分子至少可以结合 2 个 IgG。蛋白 A 也可以结合另一些免疫球蛋白，如用于某些种属的 IgA、IgM 的纯化。天然 (Native Protein A) 和重组的蛋白 A (rProtein A) 对于 IgG 的 Fc 段有着相似的特异结合。重组的蛋白 A 经改造后含有一个 C 末端半胱氨酸，可以单一位点偶联于琼脂糖

3、上，降低了空间位阻，增加了与 IgG 的结合能力。蛋白 A 与 IgG 的结合强度很大成度上依赖于该抗体的种属和亚型，而其动态结合能力则决定于结合强度 (解离常数) 及传质阻力等多种因素(例如上样时样品在柱内的停留时间)。2 Protein G Sepharose 亲和层析介质与抗体的结合蛋白 G 是一种源自链球菌 G 族的细胞表面蛋白，为三型 Fc 受体。其通过类似于蛋白 A 的非免疫机制与抗体的 Fc 段结合。像蛋白 A 一样，蛋白 G 可以与 IgG 的 Fc 区域特异性结合，不同的是，Protein G Sepharose 可以广泛、更强地结合更多类型的 IgG, 多克隆 IgG 及人

4、 IgG，同时血清蛋白结合水平更低，纯度更高，配基脱落也相对更低。此外，蛋白 G 还可以和某些抗体的 Fab 和 F (ab)2 段结合。3 Protein A 、Protein G 亲和层析方法优化由于不同抗体与蛋白 A 或蛋白 G 的亲和力不同，有必要单独优化结合和洗脱条件和层析柱载量，层析条件优化的过程可以通过用自动化层析系统如 AKTA 来自动快速完成。以下是一个杂交瘤细胞培养小鼠单抗的纯化条件探索。4 MabSelect 大规模抗体纯化新型蛋白 A 亲和层析介质MabSelect 是第一个使用高流速琼脂糖凝胶 ( High flow Agarose) 作为骨架的新型蛋白 A 层析介质

5、，专为大规模抗体纯化而设计，适合快速高效的进行抗体生产和放大，已经成 为单抗纯化和放大的标准介质。Mabselect 的特点包括：a. 高流速琼脂糖作为骨架: 介质的刚性和传质性能大大优于传统的 Sepharose 4FF 和 6FF 琼脂糖骨架，可以在大规模生产时，使用更高的流速而保持更高的载量，大大提高生产效 率。b. 更高的流速和动态载量：蛋白 A 经基因工程改造，C 端含一个半胱氨酸，形成一个定 向的硫酯键，同时增加了对 IgG 的有效结合。蛋白 A 和凝胶偶联时采用了全新的单点偶联 工艺，降低了空间位阻，因此可以在使用更高流速的条件下增加动态载量：在线形流速为 500cm/hr 和柱

6、床高度为 20cm (停留时间 2.4min) 的条件下，每毫升 MabSelect 的动态载 量可以达到30mg IgG。在纯化特性(杂蛋白去除、产品纯度等) 方面明显优于其它的蛋白 A 亲和介质。c. 更低的非特异性吸附，抗体纯度更高：和传统的 rProteinA FF 介质相同，Mabselect 介质高度亲水性的琼脂糖骨架最大程度上降低了非特异性吸附，使得洗脱峰中杂蛋白和 DNA 更少，有利于后期抗体的精细纯化。著名的抗体生产商 IDEC 公司以及 R. Hahn 的研究显示，Mabselect 对 CHO 细胞 CHOP (宿 主蛋白) 的吸附比其它蛋白 A 介质如 Prosep A

7、 低 7 倍。 Robert L. Fahrner 等对于多种商品化的 Protein A 介质的性能进行了研究比较，结果表 明:以亲水的琼脂糖凝胶作为骨架的蛋白 A 介质所得抗体的 DNA 残留量比 Prosep A 低 30%。d. 更低的蛋白 A 脱落：MabSelect 由于通过新型环氧共价交联技术，蛋白 A 的脱落比其 它同类介质低，这不仅有利于抗体纯化，还延长了介质的使用寿命，降低生产成本。微量 的脱落可以在后续的层析中，如凝胶过滤或离子交换层析有效去除。e. 生产过程无动物血清成分：配基重组蛋白 A 在大肠杆菌中表达，通过多步柱层析纯化， 完全适用于抗体药物纯化。f. 更易于工艺

8、的线性放大：通过实验室条件的优化，MabSelect 可以在保持线性流速和上 样比例等参数不变的条件下，通过增加柱直径进行线性放大。装填在内径为 60-80 厘米层 析柱时，可以在一个工作日处理超过上万升高表达的抗体培养液。MabSelect 易于清洗与除菌，寿命更长、更经济：在长期连续的生产中，介质寿命是成本 效益的一项重要指标，有效的 CIP 有助于延长介质使用寿命，但蛋白 A 配基比一般层析介 质的配基对苛刻的在位清洗 (CIP) 更加敏感，往往不能耐受 NaOH，只能使用高浓度的尿 素或盐酸胍进行清洗。而 MabSelect 的 CIP 和除菌程序简单，一般用很常规和经济的试剂 如 5

9、0 mM NaOH + 1M NaCl 或 50 mM NaOH + 0.5 M Na2SO4 溶液就可以有效去除沉淀和变 性物质; 用非离子去污剂或酒精可以去除通过疏水作用结合的物质；用 0.1M 醋酸和 20%酒 精可以 SIP 除菌。由于 CIP 所使用的化学试剂不能被重复使用，CIP 试剂的成本对整个生 产成本的影响不容忽视。使用尿素、盐酸胍等作为 CIP 试剂，长期的 CIP 成本甚至超过了 蛋白 A 介质本身的价值 。经测试，Mabselect 配合 CIP (50 mM NaOH + 1 M NaCl) 纯化 三百次后，抗体产品纯度与回收率不变。5 MabSelect Xtra

10、载量更高的商品化蛋白 A 亲和层析介质Mabselect Xtra 介质是目前市场上所有的商品化蛋白 A 介质中载量最高的亲和层析介质， 其动态载量超过 41mg/ml 介质(2.4min)。在工艺生产过程中可以有效减少层析柱的体积， 从而降低生产成本。Mabselect Xtra 介质是在 Mabselect 介质的基础上优化而来，它使用孔径更大的多孔高流 速琼脂糖 (high flow agarose) 作为骨架，同时减小介质粒径 (75u)。这样不仅增加了比 表面积和配基密度，还降低了传质阻力，从而有效的增加动态载量。R.Hahn 等的数据表明 Mabselect Xtra 的载量高于

11、Prosep vA Ultra 等其它蛋白 A 亲和介 质。K. Swinnen 等 42 也对近年来较新的蛋白 A 亲和介质进行了比较，结果显示： Mabselect 的动态载量几乎不受样品中抗体浓度的影响，因而 Mabselect 介质的工艺耐用 性 (Robustness) 最好；而 Mabselect Xtra 的载量最高，Mabselect Xtra 对 CHO 细胞 HCP (宿主蛋白) 的吸附比其它蛋白 A 介质更是低了近 10 倍。除载量更高外，Mabselect Xtra 的性质和 Mabselect 相似，比传统的 Sepharose 4FF 介质 流速更快，刚性更好；可以

12、使用 50mM NaOH+1M NaCl 进行有效的 CIP；0.1M 醋酸 in 20% 乙醇用于 SIP 消毒；也具有极低的非特异性吸附，产品纯度高，介质寿命长 40。6 Mabselect Sure 唯一耐强碱的蛋白 A 亲和层析介质在生物药物的生产过程中，为避免细菌、内毒素或病毒的污染，需要对层析系统、介质等 进行在位消毒 (SIP)，以保证产品的质量。另外，变性的蛋白、脂类和 DNA 等分子会不可 逆的沉淀在层析柱的顶部而降低柱效和传质速度，从而影响收率和产品质量。0.11N 的氢氧化钠可以有效的除菌除热原以及灭活病毒，而且对于沉淀的蛋白、脂类和核 酸具有很好的溶解作用，可以有效的对

13、层析介质进行在位清洗 (CIP) 而延长使用寿命，因 此使用氢氧化钠进行消毒和清洗成为生物制药生产中 SIP/CIP 的经典方法。这一点对于内 毒素要求极为严格的抗体生产来说尤为重要。但天然或重组的蛋白 A 配基对 NaOH 非常敏感，强碱性条件下易变性或脱落，因此只能选用 高浓度的盐酸胍或尿素进行清洗，但清洗的效果远远不如 NaOH，而且清洗成本非常高。天然或重组的蛋白 A 配基具有 5 个不同的抗体 Fc 结合结构域，每个域均可以和 IgG 的 Fc 段结合，但不同的域结合强度略有差异。将其中的 B domain 中对碱敏感的 Asp 氨基酸突 变为耐碱的氨基酸，得到新的四聚体配基 SuR

14、e Ligand，将此新配基偶联到高流速琼脂糖 基质上，成为耐碱的新型高流速 Mabselect SuRe 蛋白 A 层析介质。Mabselect SuRe 的优点：a. Mabselect Sure 可以耐受 0.10.5N 的氢氧化钠：使用高达 0.5N 的氢氧化钠进行在位 清洗/消毒大大降低了抗体产品被内毒素污染和批间交叉污染的风险，清洗效果更好，有利 于延长介质使用寿命，同时也大大降低了 CIP/SIP 的成本。Mabselect SuRe 介质可使用 0.1N NaOH 15min/circle 进行“纯化-清洗”循环 200 次以 上仍保持稳定的载量，对碱的耐受性远远好于其它的蛋白

15、 A 亲和层析介质。R.Hahn 的研究也表明：与其他蛋白 A 亲和介质相比，Mabselect SuRe 具有无可比拟的稳 定性，配基脱落最少，寿命最长，而且宿主蛋白 HCP 的残留比 Prosep A 低 10 倍以上。b. 更温和的洗脱，避免抗体聚集，提高收率：新的 SuRe 配基是一个同型四聚体配基，避 免了不同配基与抗体 Fc 段亲和性的差异，也消除了某些域对 Fab 段的亲和作用，使得洗 脱条件更加均一而温和。相比以 rProtein A 为配基的介质，Mabselect SuRe 介质可以用 更高的 pH 进行洗脱，有效的避免抗体在低 pH 下的聚集，产品纯度和均一性更高，浊度也

16、 更低。c. 不同抗体洗脱所需 pH 差异小：由于消除了对抗体 Fab 段的亲和作用，使得同一种属亚 型的不同抗体分子洗脱所需的条件更接近，有利于平台技术的建立，进一步降低了不同的抗体分离纯化工艺的研发成本。d. SuRe 配基稳定性更好：新型的 SuRe 配基对碱和蛋白酶更稳定 47，纯化过程中脱落更 少 (10 ppm)，有利于后期泄漏配基的进一步去除。甚至只有 1-3ppm 的脱落，无需在后续 步骤中增加专门去除 Sure 配基的步骤，即可达到 FDA 的蛋白 A 配基残留标准。Mabslect SuRe 介质是市场上唯一耐碱的蛋白 A 亲和层析介质，寿命最长，稳定性最好， 这一点已被文献所证实。纯化所得的抗体除蛋白 A 泄漏更少、纯度更高之外，其它产品性 质 (如 CHOP、电泳、IEF 等) 和 Mabselect 介质相当。目前，已有多家大规模抗体生产厂商，将其它蛋白 A 亲和胶转换为寿命更长、稳定性更好 的 MabSelect SuRe 用于抗体生产。MabSelect SuRe 也成为市场上销量最大的抗体生产亲 和凝胶。