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1、利用芸苔属物种的蛋白质酶解液生产肉类香精利用芸苔属物种的蛋白质酶解液生产肉类香精摘要：芸苔属植物的蛋白质是通过碱萃取后用酸沉降得方法制备。一种双酶法(中性蛋白酶 和 风味蛋白酶) 通过两个水解阶段来水解芸苔属物种植物。蛋白质和水解产物用于生产肉香味调味料。挥发性产物是蛋白质水解液和其他添加剂通过热反应产生的，研究加工工艺条件对挥发性产物的影响。结果表明：温度和pH值不仅影响产品数量也影响产品质量。产生最佳风味和挥发性产物的量最高是在160，pH4.0时，然而在180，pH8.0时有烧焦气味产生。利用响应曲面分析表明，反应pH值和温度对产生挥发性产物的数量有十分重要的影响。利用气相色谱-质谱联用
2、仪分析表明大部分的反应产物出现在已经被确定的食品风味模型系统中。关键词：芸苔属植物、蛋白质、酶解产物、香精的产生。1. 介绍芸苔属植物的种子处于世界油料生产的第三位，在大豆和棉籽之后，在花生和向日葵之前。芸苔属植物包括广为人知的菜籽油农作物和被称之为油菜籽的越发传统的品种的。尽管这些油被广泛使用，但是膳食中的蛋白质还没有被用到人类营养学中，尽管他们具有很高的生物价值。至少在传统品种中，它们反映含有相当高的不受欢迎的非蛋白质化合物 芥子油苷，它们分解膳食中营养物、塑料、肌醇六磷酸。许多工艺已经被发明用来减少膳食中的这类化合物的含量，一种具有低含量芥酸和低含量滋养地不良芥子油苷的“双零”品种已经被
3、发明。然而，这些蛋白质产品仍然包含芥子油苷和其他抗营养因子水平，这些水平太高以至于被称为人类食物适合的蛋白质来源。芸苔属植物的蛋白质含有一个极好的必需氨基酸平衡，蛋白质中赖氨酸含量的平均值大约为 6.0%。此外，蛋白质中大约有 3.0%4.0%的含硫氨基酸、蛋氨酸、半胱氨酸，这些必需氨基酸的比例接近于粮食和农业组织描述的理想层次。所以才连续不断的致力于研究芸苔属植物水解蛋白，为了提高它的功能与营养价值，或者是改善制备生物活性肽的方法。而且，人们发现用不同酶制备菜籽油蛋白水解液拥有抗氧化活性。与大豆蛋白相比，芸苔属植物蛋白可以生产更多的挥发性含硫化合物在热反应过程中。然而，芸苔属植物蛋白水解液用
4、于原料生产“热反应型”调味料的资料是有限的。 “热反应型”调味料是比较近代的食品调味料术语，这些食品调味料是通过加热两种或多种先导原料极小心地控制条件产生的。在这个过程中主要的反应是美拉德反应。结果表明水解蛋白作为食品调味剂是很有用且很重要的。然而，在加酸水解蛋白质过程中，不良副产物会产生，包括植物性蛋白和肉蛋白水解液中的肌苷酸中的 1-氯-2,3-丙二醇和 1,3-二氯-2-丙醇。因此，酶法水解植物性蛋白有潜力成为一种合适的制备调味料的方法。在这个研究中，芸苔属植物蛋白用于生产香料物质且用定量定性方法去分析他们。研究 pH 值、温度和蛋白质水解度对产物的风味特征和数量的影响。此外，利用气相色
5、谱-质谱联用仪来鉴别和描述产物。2. 材料和方法材料和方法2.1. 酶中型蛋白酶 As1.398, 酶活力 6.2 _ 104 pu/g, 购买于中国无锡杰能科国际有限公司风味蛋白酶,酶活力 500 LAPU/g, 生产于丹麦诺维信公司.2.2.制备芸苔属植物蛋白甘蓝型油菜种子来自于郑州一个石油加工厂，用 80 目去研磨，并在 30-60下用石油醚脱脂。粉状物用碱性溶液抽提（0.01mol 的氢氧化钠，物料比是1:10，在室温下 20 分钟） ，然后用离心机离心分离不溶性残渣。剩下的残渣继续用可溶性无机盐抽提（物料比 1:5） ，并用离心分离不溶的残渣。可溶性蛋白是通过用盐酸来调节 pH 值进
6、行纯化，通过两个过程的沉淀来从新获得芸苔属植物的蛋白，先调节 PH 值为 6.0，然后在调节为 3.6。将沉淀蛋白溶于水（质量比为 8%） ，调节 pH 值为 7.0。B-290 微型喷雾干燥器用来干燥悬浮液，入口温度为 160，加料速度为 10ml 每分钟，出口温度是 80。制备的合成蛋白中蛋白含量是 71.3%（蛋白因子是 6.25） 。2.3.芸苔属植物蛋白的酶法水解可以使用多种多样的酶处理。首先芸苔属植物先只用中性蛋白酶在50，pH值为7.6，酶与底物比是3700(Pu/g)，底物与溶剂比是10%。中性蛋白酶酶解时间一般是1、2或3小时。一系列进一步深层次水解是用中性蛋白酶酶解3小时，
7、紧接着用风味蛋白酶在55，pH值是6.2，酶与底物比是37(LAPU/g)，底物与溶剂比是10%。风味蛋白酶的酶解时间一般是1、2、或3小时（不包括中性蛋白酶水解的3小时） 。完成酶解后，将酶解液加热至90，目的是为了抑制酶作用。得到的悬浮液用离心机在2800转速每分钟离心15分钟，取出不溶性杂质。水解度被定义为酶解液中游离的氨基酸与蛋白质中总氨基酸的比值，而游离氨基酸可以用水合茚三酮来测定。2.4.热反应的准备和挥发性物质的抽提将0.1g半胱氨酸很1.0g木糖混合溶于20ml 芸苔属植物蛋白水解液中。用磷酸缓冲溶液（0.01M）将上述溶液定容至50ml，调节pH值为4.0、6.0、8.0。然
8、后转移至反应容器内，并在100180内的不同温度下反应。等反应进行至2小时时，冷却至室温，用二氯甲烷将反应混合物抽提两次，第一次是100ml,第二次是50ml.在溶解过程中残留的水通过钠硫酸盐去除。溶剂萃取是在氮气缓缓流动的情况在集中到0.5ml。在气相色谱-质谱联用仪分析之前用十二烷被加入浓缩液中作为内部标准。2.5.气相色谱分析气相色谱分析使用日本岛精公司制造的GC-17A气相色谱仪（日本岛精公司，京都，日本）装有PEG-20柱（25 m * 0.32 mm id） （日本岛精公司，京都，日本），离子化火焰检测仪用来定量挥发性化合物。注射器和检测器的温度都设置在200。烘箱温度控制在40且
9、维持10分钟，然后从40-160以直线性每分钟2增加，加热到160时为50分钟，用50:1的分流比。样品分析一式三份，挥发性物质数量以毫克每100ml的反应溶液来表示。色谱的数量峰对应一定数量的产物。2.6. 响应曲面分析响应曲面分析方法越来越多的应用于评估多个因素的影响和他们之间关系。响应曲面是一个用来设计实验的统计技术，建立模型，考虑几个因素的影响和为了获得理想反应条件而评估最佳条件。与此方法，在响应曲面分析方法中可能影响参数之间的相互关系可以用几组有限的计划实验来评估。因此，这个实验的主要目的是用形影曲面分析方法研究pH值、温度、时间之间的关系对挥发性物质的数量和产物数量的影响。一个用三
10、个独立自变量设计的三水平的箱线图用于合适的响应函数，且与相对应的感官评分在表1中给出。2.7.对产物的感官评价为了评估热反应产物的风味特征，挑选并培训7个专业感官评分员。他们被要求描述热反应产物的风味特征是无肉香、煮肉香、烤肉香或者焦臭味，而且用喜欢的程度如不喜欢、喜欢、非常喜欢等来评价他的风味。2.8.气相色谱-质谱联用仪分析热反应产物和挥发性抽提物以上述所描述的在不同条件下制备的方法：在pH值为4（100、120、140、160、180） ，pH值为6（100、120、140、160、180） ，pH值为8（100、120、140、160、180） 。所有挥发性物质进行了合并，且这些混合物
11、用于气相色谱-质谱联用仪来分析。这些是用日本岛精公司的GC-17A气相色谱仪和QP-5000质谱仪操作的。操作条件是上述所描述的，质普师在70伏特是解离电子获得。3.结果与讨论3.1. 水分活度对产物的影响酶解液是根据上述所描述的方法制备的。分别酶解1、2、3、4、5、6小时六个样品，且相对应的水解度分别是5.15%、 11.5%、 13.0%、16.4%、21.5%和26.8%。每个样品都用于反应产生芳香物质。结果表明，不同水解度的酶解液产生的挥发性物质的量也不同，且随着水解度增加而增加。在这个基础上，将进一步研究水解度为26.8%的酶解液。3.2. PH值对产物的影响在相对较低的温度下（1
12、00和120） ，pH值为8时获得的挥发性物质比pH值为6时多。另外，在160-180时，pH值为4是产生的挥发性化合物的量比pH值为6和pH值为8时多。挥发性物质的成分受pH值影响。在160-180时，pH值为4时的挥发性产物的种类比pH值为6和pH值为8时多。但是，100、120、140时，pH值为6时挥发性产物的种类比pH值为4和pH值为8时多。结果表明，pH值对美拉德反应产物影响很大。美拉德反应取决于三个阶段。初期阶段开始于一个氨基和一个还原糖的缩合，在被称作Amadori重排反应生成氨基脱氧酮糖（或者当还原糖是酮糖时是Heyns重排产物） 。中期阶段开始于将Amadori/Heyns
13、重排产物进一步降解并释放氨基。最后阶段是包括各种各样的脱水、降解、环化、聚合反应，其中氨基基团参与各个反应。与香气形成极其重要的是被叫做Strecker降解阶段，在这个过程中氨基酸被宰美拉德反应中产生二羰基化合物降解，使氨基酸脱去氨基和碳酸基。必须被提及的是在缺乏氨基基团的糖降解产生类似产物，但是在美拉德反应，氨基基团扮演催化剂的作用，所以美拉德反应导致的是一个更快更高产量的反应中间产物。许多可能的反应路线绝大数取决于温度、pH值和天然产物。一些研究工作已经开始研究pH值与美拉德感应产生挥发性产物之间的关系。在模型体系中，所有芳香物质和天然挥发性化合物都受pH值的影响。蛋氨酸系统中的主要产物是
14、二甲基二硫化物和3-（甲硫基苯酚）丙醛，而且当pH值增加时，后来合成的物质在浓度上有微小的减少，然而观察到二硫化物有所增加。在半胱氨酸体系中，低pH值导致大量硫化物合成，包括2-甲基-3-巯基呋喃，一种拥有强烈肉味的化合物。马德鲁加和莫特拉姆研究发现pH值是通过煮肉方式来影响美拉德反应过程中得到的芳香挥发性物质。挥发性物质的总量是随着pH值的增加而增加的。在酸性条件下，许多巯基呋喃化合物和氧化物优秀合成。其他杂环化合物如噻唑、吡嗪喜欢在碱性条件下生成。吡嗪是含氮的杂环化合物的一种。这些化合物是很重要的风味物质，对食品的感官特征上有显著的影响。Bemis-Young, Huang, 和 Bern
15、hard 在较为广泛的pH值范围内研究pH对吡嗪化合物在葡萄糖-甘氨酸模型体系内合成的影响。当pH增加时，吡嗪化合物的量也随之增加。最大品种的吡嗪化合物是在pH为9.0和pH为9.64时生成。Martins 和van Boekel 研究过葡萄糖-甘氨酸美拉德反应路线动力学，结果证明最初的pH对速率常数有不同 影响。所以挥发物的量随pH变化可以用在美拉德反应中产生的不同浓度的中间产物来解释。这表明氨基酸中官能团的质子化是很重要的。3.3. 温度对产物的影响温度对挥发性物质的量和种类的影响见表2。在pH值为4、6、8时，挥发性物质的数量全部随着温度的升高而升高。当温度低于140时，在pH为4时的挥
16、发性物质量的提高速率与pH为6和pH为8相似。但是当温度高于140时，在pH为4时的挥发性物质量的提高速率比pH为6和pH为8迅速。在pH值为4、6、8时，挥发性物质的种类也随着温度的提高而提高。这可能归因于涉及的复杂的自然反应路线和不同加工条件的影响。应用简单动力学的传统方法不是十分有效，因为它适合只有单一的一步。此外，正如预期的，数据证明温度对反应速率有明显的影响。总而言之，在高温下速率快于低温条件，所以在高温下可以产生更多的产物。3.4. pH值、温度、反应时间之间的相互关系响应曲面用于评估反应中pH值（X1）、温度（X2，）和时间（X3，h）相互之间的影响关系。根据三水平箱线图设计三个变量，用15分为测试总分。结果取决于挥发性风味物质的量和产品种类，并呈现在表1中。设计专业软件 V7.1 是用于分析实验结果和最后依据挥发性物质的相关因素的方程：挥发性化合物的量（mg/100 ml）和挥发性化合物的量:挥发性数字关于响应曲面的二次方程式模型的方差分析见表 2。回归数据证明，该模型对挥发
