《外源基因在大肠杆菌中表达简略实验步骤》由会员分享，可在线阅读，更多相关《外源基因在大肠杆菌中表达简略实验步骤（3页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、 目的基因在大肠杆菌中的诱导表达目的基因在大肠杆菌中的诱导表达一般程序如下：获得目的基因准备表达载体将目的基因插入表达载体中（测序验证）转化表达宿主菌诱导靶蛋白的表达表达蛋白的分析扩增、纯化、进一步检测。主要试剂主要试剂1、LB 培养基。2、100mM IPTG（异丙基硫代-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG 溶于100ml ddH2O 中,0.22m 滤膜抽滤，-20保存。操作步骤操作步骤1、通过 PCR 方法获得目的基因：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点，本实验中为 BamH和 Hiind） ，PCR 循环获得所需基因片段。PC
2、R 反应体系为：模板（含 R 基因的重组质粒）1l上游引物 PR11l下游引物1ldNTP（2.5mmol/L）5l10PCR buffer（含 Mg2+）10lTaq 酶1lddH2O 补至100lPCR 反应条件为：94变性 3min；94变性 3min、52复性40sec、72延伸1min，30个循环；最后72延伸8min。2、构建重组表达载体（1）载体酶切：将表达质粒 pRSETA 用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用凝胶回收 Kit 或冻融法回收载体大片段。（2）R 基因 PCR 产物双酶切后回收，在 T4 DNA 连接酶作用下连接入载体。连接反应
3、体系为：pRSETA1lR 基因片段3lT4 DNA 连接酶（5U/l）1l5buffer2lddH2O 补至10l3、获得含重组表达质粒的表达菌种（1）将连接产物转化大肠杆菌 DH5，根据重组载体的标志（抗 Amp）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。（2）测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确,进入下步操作。否则应筛选更多克隆，重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。（3）以此重组质粒 DNA 转化表达宿主菌 BL21（DE3）的感受态细胞。4、诱导表达1、挑取含重组质粒的菌体单斑至2ml LB（含 Amp50g/ml）中37过夜培养。2、按1100比例稀释过夜菌，一般将1ml 菌加入到含100mlLB 培养基的300ml培养瓶中, 37震荡培养至 OD6000.5-0.8（最好0.6，大约需3hr） 。3、取部分液体作为未诱导的对照组，余下的加入 IPTG 诱导剂至终浓度1mM 作为实验组，两组继续于37、200rpm 震荡培养3hr。4、分别取菌体1ml,，离心12000g30s 收获沉淀，用100l 1%SDS 重悬，混匀，7010min。5、离心12000g1min，取上清作为样品,可做 SDS-PAGE 等分析。6 5500rpm 15min 收集细胞7溶菌酶破碎细胞 制备过柱上清8 过柱纯化带组氨酸标签蛋白
