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1、小分子应用专题应用说明文档 28-9859-16 AAIN Cell Analyzer 2000采用心肌细胞进行多重标记活细胞毒性试验的高内涵分析在药物开发的过程中，心脏毒副作用的后期检测会大幅在药物开发的过程中，心脏毒副作用的后期检测会大幅度地增加方案的费用，还会明显地延迟上市时间。如果度地增加方案的费用，还会明显地延迟上市时间。如果 在投产之前无法检测心脏毒性，就会构成严重危及患者在投产之前无法检测心脏毒性，就会构成严重危及患者 健康的风险。随着大量的药品因意料不到的对心血管的健康的风险。随着大量的药品因意料不到的对心血管的 有害影响而代价昂贵地退出市场，对体外心脏毒性检验有害影响而代价昂
2、贵地退出市场，对体外心脏毒性检验 更为适当和随时可用的细胞模型的需求越来越大。为了更为适当和随时可用的细胞模型的需求越来越大。为了满足这一需求，满足这一需求，GEGE医疗集团现已提供分化自人胚胎干细医疗集团现已提供分化自人胚胎干细胞的心肌细胞。为了探究胞的心肌细胞。为了探究GEGE医疗集团所产的心肌细胞在医疗集团所产的心肌细胞在基于图像的毒性筛选试验中的实用性，我们用一组测试基于图像的毒性筛选试验中的实用性，我们用一组测试 化合物对这些细胞做了系列试验，包括那些带有已知或化合物对这些细胞做了系列试验，包括那些带有已知或 疑似心脏中毒倾向的化合物。通过对试验结果的高内涵疑似心脏中毒倾向的化合物。
3、通过对试验结果的高内涵 分析（分析（HCAHCA），我们得以鉴别心毒性化合物并根据它们），我们得以鉴别心毒性化合物并根据它们 的表型概况加以相互区别。的表型概况加以相互区别。引言GE医疗集团所产的心肌细胞属于一种生物性相关的、工业规模来源的生理性相关的细胞，适用于药物开发和毒性检测程序。由核型正常的人胚胎干细胞分化而来，心肌细胞已经通过电生理学、流式细胞术和亚细胞成像测定了特征。从冷藏保存状态恢复之时，心肌细胞形成有收缩性的表达心脏相关转录因子的单层细胞、结构蛋白 （图1）和功能性离子通道。图1图1. GE医疗集团所产心肌细胞表达诸如肌钙蛋白I（左）和a-放线素 （右）等心脏标记物。通过免疫细
4、胞化学方法检测结构蛋白；细胞核 用Hoechst33342（蓝）作对比染色。心脏毒素会以各式各样的方式影响细胞行为和表型，包 括干扰线粒体的呼吸、损害质膜的完整性以及触发细胞 凋亡通路。通过同时逐个细胞地监测多种毒性指标，高 内涵分析能提供一种灵敏而稳健的捕获细胞表型微小变 化的方法，这些变化可能表现出毒性，但采用电生理学 的试验或者更为常规的体外试验不容易检测出来。在本实例中，采用一个多重标记试验就测试化合物对GE 医疗集团的心肌细胞造成的影响做了检验，该多重标记 试验混合使用了四种荧光探针。这些探针能同时测量与 质膜完整性、钙动员、核表型和线粒体状态有关的细胞 参数。活细胞自动成像与分析产
5、生了大量的细胞测量结 果，可用于监测多方面的细胞行为与功能。通过快速收 集复制的细胞样本和对照组的详细信息，生成了测试化合物的表型概况，从而论证了利用GE医疗集团的心肌细 胞所做的高内涵分析能够提供有关检测与鉴别有心毒性 倾向的化合物的大量信息。67小分子应用专题方法试验心肌细胞以每个试孔40,000个细胞的单位接种到涂覆Matrigel（BD公司产）的96孔经组织培养处理的Clear培养板（Greiner Bio-One）上，此前采用了GE医疗集团“ 心肌细胞用户指南（28-9805-86 AA）”中所述的培养板涂层和细胞制备的方法。接种之后，将复制的培养板置于37C下孵育48h。然后更换试
6、验培养基（用B27 2% v/v补充RPMI 1640），将接种后的孵育继续进行到6天，其 间按GE医疗集团“心肌细胞用户指南”所述方法隔天更换一次试验培养基。心肌细胞在37C下孵育2472 h，测 试化合物则按0300 的最后浓度在试验培养基中制备。在试验培养基中制备一种探针溶液，以便提供1 的Hoecsht 33342（分子探针）、20 nM的四甲基若丹明（TMRM）（Invitrogen）、1 M的Fluo-4 AM（Invitrogen）和1 M的TOTO-3碘（Invitrogen）的终浓度（该试验孔内） 分别在24 h、48 h和72 h的时点上，通过明场显微镜评估了细胞的毒性形态
7、学征象。当针对某一特别设定的化合物以更高的剂量点观察到毒性证据时，增加混合探针， 在成像之前再做一小时的细胞孵育。图像采集图像分析与数据显示 胞的实时图像采集，该系统配置了大芯片的CCD摄像头和一个40x/0.6 NA的物镜。 QUAD 2多色反射镜组与下列 激发（x）和发射（m）的滤光片组合一起使用：适于Hoechst 33342的350/50x、455/50m；适于Fluo-4 AM的 490/20x、525/20m；适于TMRM的579/34x、624/40m； 以及适于TOTO-3的645/30x、705/72m。对于每一种治疗条件，使三个复制试孔其中每个的四个视野都得以显 示图像。图
8、像分析与数据显示图像自动分析在IN Cell Investigator软件上进行，采用了“开发人员工具箱”或“多目标分析（MTA）”模块。编写了 分析方案来报告总体平均和个体的细胞测量值。采用 GraphPad Prism4（GraphPad软件）对数据进行了分析和显示处理，以便画出剂量反应曲线。对于主要成分分析（PCA）、阶层式数据分组、轮廓图和多维散点图，我们使用了SpotfireDecisionSite工具（Tibco软件公司） 通过集成到IN Cell Investigator软件接口访问该工具。这 样的工具能够解释对细胞计数、细胞核表面形状和各种 线粒体参数的化合物作用加以特征化的主
9、要手段。试验结果和讨论在本试验中，我们采用高内涵分析的目的是检查六种化合物有何影响，据报告称它们会影响到心肌功能、线粒体状态或存活率。根据已公布的文献资料，可以预计某些化合物具有急性细胞毒作用，而其他化合物则与更为长期的暴露接触相关的心脏病理有关。有一种化疗剂叫阿霉素，据知会诱导急性的心脏毒性，而且已由美国食品药物管理局签发了关于心血管毒性的黑框警告。有证 据表明，阿霉素急性的心脏毒性包括通过一条Bax介导通路（3）导致的心肌细胞程序死亡（2）。这个过程还涉及一个p38 MAP依赖活化酶的氧化应激机制（4）。如图2A中的剂量反应曲线图所示，阿霉素的毒性可随时通过我们的试验做检测，该试验据报在质
10、膜完整性上减少 了剂量依赖性，同时伴有核区、线粒体外形（1/形状因 子）和胞内钙质浓度的剂量依赖性的变化。该群体（半 数中毒浓度TD 50）的诱导半数最大质膜完整性的中毒 剂量是1.6 ，与其他模型系统在文献资料中报告的值 处于同一数量级（5）。响应率（最大百分率）胺碘酮（log m）B.A.响应率（最大百分率)阿霉素（log m）图图2 2. GE医疗集团产心肌细胞暴露于浓度递增的阿霉素（A）或胺碘酮 （B），前后共计24 h。剂量反应曲线就所有情况下核区（Hoechst 33342，蓝色）、钙离子动员（Fluo-4 AM，绿色）、线粒体状态 （TMRM，橙色）和质膜完整性（TOTO-3碘筛
11、析，红色）的最大反应 百分率画出曲线图。通过非线性回归法（平均值抽样鉴定值，样本 数 = 3个复制试孔）分析数据。68小分子应用专题抗心律失常药往往对许多细胞类型都有直接的毒性作用， 其中包括心脏细胞（6，7）。胺碘酮属于III级抗心律失常药物，具有多通道的阻塞作用。如同阿霉素一样，胺碘酮也有美国食品药物管理局就其心血管毒性签发的相 关黑框警告。因为它的中毒-治疗范围（8）很狭窄，所以难以给药。用小鼠H9c2的心脏细胞做试验的结果表明， 胺碘酮具有一种促凋亡的作用，它在包括半胱天冬酶2和9（9）在内的机制介导下发生。与介导阿霉素诱导的细胞程序死亡的机制相反，有证据表明，胺碘酮的作用 通过一个不
12、依赖Bax的过程介导的，该过程不涉及自由基的产生（6），线图并未充分利用所收集的全部信息。 化合物影响作用之间的细微差异可能在图2中所考察的四个细胞参数的基础上难以鉴别。考虑在每种治疗条件下测量更大数量的细胞，这样的化合物轮廓可能更为稳健，而且在鉴别差异影响方面更为灵敏（10）。HCA影 像分析方案应用到本试验中，它从每帧图像中的每个细胞上提取了54个不同的测量值。虽然解释包含54条剂量反应曲线在内的化合物轮廓是不切实际的，但我们的确可以利用各种强大的模式检测方法对整个数据集作更为深入的分析。这样的方法通常会包含主成分分析（PCA）或分组方法，要么就是两者一并用于本试验。图图3 3. 一个多重
13、标记细胞毒性试验揭示了细胞表型上的显著差异。用阿霉素、胺碘酮或二甲基亚砜对GE医疗集团产心肌细胞处理24 h即止，然后就 线粒体状态（TMRM，红色）、钙动员（Fluo-4 AM，绿色）、DNA/细胞核状态（Hoechst 33342，蓝色）和细胞存活力（TOTO-3碘，无显示）进行 染色。对细胞用IN Cell Analyzer 2000进行成像。尽管其确切的作用机制仍不清楚。剂量-反应分析（图2B）表明，胺碘酮以正好高于典型治疗剂量的4.5 的半 数中毒浓度，诱导了质膜完整性的损失，这一剂量趋向于0.753 的范围（0.52 g/ml）（10）。胺碘酮还 影响到核区、线粒体外形和钙质疏松，
14、但药效显然不同 于通过阿霉素治疗所产生的。 对用相应的化合物（图3）处理细胞的具有代表性的图 像进行检查，结果证实：由这两种药物诱导的细胞表型 出现显著不同的差异。 正如本实例的讲解那样，细胞成像可能不仅要鉴别具有 潜在心毒性倾向的化合物，而且还要区分不同的有毒化 合物并根据它们的反应曲线按相似性分组。虽然四色毒 性试验的高内涵分析从试验中获得了大量逐个细胞的数据，但图2所示的常规的剂量反应曲PCA是一种性能优异的工具，适于简化错综复杂的多参数高内涵分析数据，从而揭示化合物影响作用的总趋势和差异。此法包括精确地转换大量的多元数据组，以便导出数量上更容易管 理的不相关变量，即所谓“主要成份”。在
15、本试验中， 利用PCA分析将来自每种治疗条件的54个细胞参数简化 为三大主要成分。主要成分的多维曲线图（图4）使我们得以对所有的数据一目了然，还能就测试化合物突出显示一些分组和剂量依赖性。显而易见，三种测试化合 物（阿霉素、胺碘酮和抗霉素A）诱发了明显不同的细 胞表型，特别是采用更大剂量的情况下。如同阿霉素一 样，抗霉素A涉及通过线粒体超氧化物的产生介导的心肌毒性（11）。由阿霉素诱导的表型在整个浓度范围内 以依赖剂量的方式形成，而抗霉素A和胺碘酮看来似乎 诱发了一种阈值型的响应。69小分子应用专题胺碘酮递增药物抗霉素A阿霉素图图4 4. 对六种化合物试验的PCA分析揭示了化合物作用的总体差异
16、。（A）：在每个轴上画出一种主要成份的曲线；（B）：前两个主要成份分别在 x、y轴上画出曲线，以箭头连接各点以显示药物的递增浓度。在两条曲线上，数据点按化合物标色，如图中关键点所示。相比之下，双氯芬酸、齐多夫定（又称AZT）和硝苯地 平都具有PCA轮廓，它们与DMSO对照组更为相近，表现出动态范围更小的响应。虽然所有这些化合物均在某方面与有害的心血管影响相关，但有文献资料表明它们 的破坏作用可能是累加的、渐增的，急性细胞毒素比阿 霉素、胺碘酮和抗霉素A的更低，而急性细胞毒素会触 发细胞凋亡途径。包括双氯芬酸在内的非甾体抗炎药 （NSAIDs），都是非特异性地抑制环加氧酶，也均与心脏毒性有关。长期采用双氯芬酸治疗与导致充血性心力衰竭有一定关联，其机理迄今尚未确定。尽管作为2004年撤销环加氧酶抑制剂罗非昔布（Vioxx）的结果针对非甾体抗炎药发出了黑框警告，但相对大量的试验仍未发现使用双氯芬酸（12）与心血管危险的增加有关联。抗逆转录病毒药物齐多夫定尚未涉及急性的心脏毒性，但与作为长期治疗用药的结果而出现的心肌病有关（1
