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1、摘要本文基于 2015 年版中国药典1 中采用液质联用技术分析胶类药材的定性方法，开发了稳定、快速、灵敏的三重四极杆液质联用 (LC/QQQ) 法和四极杆飞行时间液质联用 (LC/Q-TOF) 法进行阿胶、鹿角胶、龟甲胶的定性鉴别；同时，利用 Q-TOF 强大的化合物定性能力，结合蛋白质库，建立了特征肽段序列分析方法以及“假药”的初步定性方法。前言胶类药材是我国传统中药中一类特殊的动物药，是由动物的皮、骨骼等经特殊工艺加工而成，常见的有阿胶、鹿角胶、龟甲胶及其相关中成药制剂。近年来，随着胶类药用量增长，原料资源供不应求，新闻曝光了一些不法生产企业为降低成本，采用其它动物杂皮投料，给消费者的健康
2、带来严重隐患。为了保障公众用药安全有效，2015 年版中国药典1 制订了符合胶类药材特点的定性方法：采用液质联用技术，分析阿胶、鹿角胶、龟甲胶的特征肽段，方法专属性强、科学可靠。安捷伦科技公司针对这一变化开发了稳定、快速、灵敏的三重四极杆液质联用 (LC/QQQ) 法，进行阿胶、鹿角胶、龟甲胶的定性鉴别。同时，鉴于很多实验室有高分辨质谱测试需求，我们在药典 LC-QQQ 方法的基础上，开发了四极杆飞行时间液质联用 (LC/Q-TOF) 法。此外，利用 Q-TOF 强大的化合物定性能力，结合蛋白质库，建立了特征肽段序列分析方法以及“假药”的初步定性方法。采用安捷伦液质联用技术对 胶类药材进行鉴定
3、应用简报作者胡楠 左帅 杜伟 薄涛安捷伦科技（中国）有限公司制药行业2实验部分试剂和样品材料实验用色谱纯乙腈购自 Merck，色谱纯甲酸购自 Dikma，超纯水为 Milli-Q 系统制备，碳酸氢铵购自 ACROS，胰蛋白酶购自 Promega。样品材料为市售阿胶、鹿角胶、龟甲胶。仪器Agilent 1290 Infinity II 超高效液相色谱Agilent 6460C 三重四极杆质谱仪Agilent 6530 四极杆飞行时间质谱仪样品制备取样品粉末 0.01 g，加 1% 碳酸氢铵溶液 5 mL，超声处理 30 分钟后，用 0.22 uM 微孔滤膜过滤，取续滤液 100 L 置微量进样瓶
4、中，加胰蛋白酶溶液 10 L（采用序列分析用胰蛋白酶，加 1% 碳酸氢铵溶液制成每 1 mL 中含 1 mg 胰蛋白酶的溶液，临用时配制） ，摇匀，37 C 恒温酶解 12 小时。色谱条件色谱柱： Eclipse Plus C18（2.1 x 100 mm，1.8 m）柱温： 40 C进样体积： 5 L流速： 0.3 mL/min流动相： A：H2O 含 0.1% 甲酸；B：乙腈梯度洗脱： 0 min 5%B；25 min 20%B；40 min 50%B三重四极杆串联质谱条件质谱系统： Agilent 6460C离子源： 配备安捷伦喷射流的 ESI模式： 正离子雾化气： N2雾化气压力： 3
5、0.0 psi干燥气温度： 325 C干燥气流量： 8.0 L/min毛细管电压： 3500 V鞘气温度： 350 C鞘气流量： 12.0 L/min喷嘴电压： 0 VDelta EMV： 0 V扫描模式： MRM表 1 中列出了与待测物相关的 MS MRM 参数表 1. 三重四极杆串联质谱 MRM 参数化合物名母离子MS1 分辨率子离子MS2 分辨率驻留时间碎裂电压 (V)碰撞能量 (eV)阿胶539.8Unit612.4Unit10012020阿胶539.8Unit923.8Unit10012020鹿角胶765.4Unit733.0Unit10013515鹿角胶765.4Unit554.0
6、Unit10013520龟甲胶631.3Unit921.4Unit10012030龟甲胶631.3Unit546.4Unit100120183四极杆飞行时间质谱条件质谱系统： Agilent 6530离子源： 配备安捷伦喷射流的 ESI模式： 正离子雾化气： N2雾化气压力： 30.0 psi干燥气温度： 325 C干燥气流量： 8.0 L/min毛细管电压： 3500 V鞘气温度： 350 C鞘气流量： 12.0 L/min喷嘴电压： 0 V扫描速度： 3 谱图/秒扫描模式： 鉴定采用 Target MS/MS， 未知肽段定性采用 Auto MS/MS表 2 中列出了与待测物相关的目标质量数
7、结果与讨论基于 2015 年版中国药典开发的 LC/QQQ 法分析胶类药材，重现性好、灵敏度高。阿胶、鹿角胶、龟甲胶各 MRM 通道信噪比均大于 500，其中龟甲胶的 631.3546.4 通道信噪比大于 77000（如图 1 所示） ，完全能够满足 2015 年版中国药典信噪比大于 3:1 的要求。X104 6543210X104 6 5 4 3 2 1 0X103 1.510.50 12345678910 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 2526 27 2829 30 3132 33 34 35 36 37 38 39 ? vs. ? (
8、min)图 1. 采用 LC/QQQ 法分析龟甲胶所得 TIC 及 MRM 色谱图，其中 631.3546.4 通道信噪比大于 77000，从上到下依次为：TIC 色谱图，通道 631.3546.4 和 631.3921.4 的 MRM 色谱图表 2. 四极杆飞行时间质谱目标质量数列表化合物名质量价态窗口宽度碰撞能量 (eV)阿胶539.78622Medium20鹿角胶765.71082Medium15鹿角胶765.71082Medium20龟甲胶631.33552Medium30龟甲胶631.33552Medium184采用 LC/Q-TOF 法分析胶类药物时，利用 Target MS/MS
9、 模式采集数据，运用高分辨 EIC 碎片离子提取技术进行数据处理，可以获得与 LC/QQQ 法一致的定性结果。阿胶、鹿角胶、龟甲胶各特征离子信噪比均大于 200，同样完全满足 2015 年版中国药典信噪比大于 3:1 的要求。图 2 为采用 LC/Q-TOF 法分析龟甲胶所得特征碎片离子色谱图。X105 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0X1053210X104 1.2510.750.50.250 12345678910 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37
10、38 39 ? vs. ? (min)图 2. 采用 LC/Q-TOF 法分析龟甲胶所得高分辨特征碎片离子色谱图，其中 631.3546.4 通道信噪比大于 44000，从上到下依次为：两个特征离子提取色谱图，通道 631.3355546.2769 和 631.3355921.4776 的提取离子流图，提取离子窗口宽度 50 ppm除了药典规定的离子对外，还可结合文献报道2,3 的特征肽段，采用 QQQ SIM 模式或 Q-TOF 提取离子模式进行胶类样品的专属性鉴别，杜绝掺假样品。图 3 为阿胶特征谱图。X1062.221.81.61.41.210.80.60.40.20? vs. ? (m
11、in)12345678910 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 2526 27 2829 30 3132 33 34 35 36 37 38 39 40图 3. 阿胶特征谱图：1. m/z 469.2；2. m/z 618.8；3. m/z 539.8；4. m/z 765.95此外，Q-TOF 可以提供可靠的 MS 和 MS/MS 数据，其具有强大的化合物定性能力，结合蛋白质库，可以进行特征肽段的序列分析。图 4 和图 5 展示了阿胶中上述特征肽段 m/z 618.3 二级质谱图及其序列分析结果。该特征肽段位于驴的 I 型胶原蛋白 2 链上第
12、 692 706 位置上，氨基酸序列为 G-E-A-G-A-A-G-P-A-G-P-A-G-P-R。X104 7 6.5 6 5.5 5 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0.5 0 75 100 125 150155.0811187.0709258.1083 329.1862386.1664457.2028554.3036618.1097722.3945850.4538779.4157921.4897978.5142175200 225 250275 300 325350375 400 425 450 475500 525 550 575 600625 650 675 700
13、725 750 775 800825 850 875 900925 950 97510001025105010751100 ? vs. ? (min)图 4. 阿胶中特征肽段 m/z 618.3 的二级质谱图图 5. 阿胶中特征肽段 m/z 618.3 的序列分析结果此种高分辨二级质谱结合蛋白质库的 Q-TOF 分析方法也可扩展到“假胶类药材”分析上。检测时发现一市售龟甲胶未检测出特征离子（图 6） ，于是对其进行 Auto MS/MS 模式分析，经蛋白质库检索发现多段属于牛皮胶原蛋白的特异性肽段（图 7） ，推测这份龟甲胶可能是用牛皮或相关产品仿冒的。通过此方法可有效的对“假胶类药材”进行初
14、步定性分析，为打假工作提供了有效依据。6X1071.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0X10410.80.60.40.20 X10410.80.60.40.20123456789 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 ? vs. ? (min)图 6. 某市售龟甲胶未检出龟甲胶特征定性离子，从上到下依次为：MS 总离子流图、通道 631.3546.4 和 631.3921.4 的提
15、取离子流图X104 32.521.510.50X104 32.521.510.50 X10443210 10020030040050060070080090010001100120013001400150016001700 ? vs. ? (min)图 7. 某市售龟甲胶中发现的牛皮胶原蛋白特异性肽段，从上到下依次为：牛皮胶 I 型胶原蛋白 1 链上第 781 795 氨基酸序列、2 链上第 950 607 氨基酸序列、2 链上第 1066 1078 氨基酸序列7结论分别采用 Agilent 6400 系列 QQQ 和 6500 系列 Q-TOF 液质联用系统，针对 2015 版药典收载的阿胶
16、、龟甲胶、鹿角胶三种胶类药材进行定性方法开发，结果表明，阿胶、龟甲胶、鹿角胶的信噪比远远优于药典的要求。在此基础上，开发了胶类药品的专属性肽段鉴别方法以及特征肽段序列分析方法，并将特征肽段分析成功应用于一例“假龟甲胶”的鉴别中。参考文献1 中国药典2015 年版第一部2 胶类药材质量控制关键技术研究北京中医药大学博士论文，作者：程显隆3 Xian-Long Cheng et.al. Identification of five gelatins by ultra performance liquid chromatography/time-of-flight mass spectrometry (UPLC/Q-TOF-MS) using principal component analysis. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 62 (2012) 19
