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1、中国蔬菜学术论文下载 www. c n v e g . o r g叶用莴苣磷转运蛋白 LsPHT1 基因的克隆 及其在纳米材料处理下的表达汪玉洁 陈日远 刘厚诚 宋世威 苏 蔚 孙光闻*（华南农业大学园艺学院，广东广州510642）摘 要：以叶用莴苣品种耐抽薹意大利生菜为试材，采用 RT-PCR 结合 RACE 技术，克隆磷转运蛋白 LsPHT1 基因序列；并利用半定量 PCR 结合实时荧光定量 PCR 技术检测叶用莴苣在纳米材料处理下 LsPHT1 基因的表达情况。结果表明：LsPHT1 基因的开放阅读框为 1605bp，编码 534 个氨基酸，推测蛋白质分子量为 58.5kD，具有 PHT
2、1 家族的保守特征序列GGDYPLSATIxSE，与菊花 PHT 氨基酸序列同源性高达 88%。LsPHT1 仅在叶用莴苣根部表达，而在叶片中几乎不表达。在叶用莴苣全生长期内，LsPHT1 的表达量呈先上升后下降的变化趋势。在生长中后期，纳米材料处理的叶用莴苣根部 LsPHT1表达量显著高于对照，说明 LsPHT1 的表达受纳米材料的诱导上调。关键词：叶用莴苣；磷转运蛋白基因；克隆；纳米材料；基因表达个 家 族：PHT1、PHT2、PHT3 和 PHT4（Poirier&Bucher，2002；Guoetal.，2008） ，每个家族分别含有不同数量的成员。磷转运蛋白根据 Km 值可以分为低亲
3、和磷转运系统（lowaffinity）和高亲和磷转运系统（highaffinity）两大类（Raghothama，1999；Gordonweeksetal.，2003） 。近年来通过基因组测序和同源基因克隆等技术手段，从苜蓿、水稻、拟南芥、 小麦、 大麦、 玉米、 番茄、 马铃薯、 烟草、 辣椒、茄子、百脉根、矮牵牛等的基因组中鉴定到多个编码高亲和磷转运蛋白基因（张晓，2014） 。这些基因大多数属于 H+/H2PO4-共转运体的 PHT1 家族，可能具有吸收土壤溶液中低浓度可溶性磷和在植物汪玉洁，女，硕士研究生，专业方向：蔬菜生理及分子技术，E-mail：* 通讯作者（Correspondi
4、ngauthor） ： 孙光闻，女，副教授，硕士生导师，专业方向：蔬菜栽培生理，E-mail：收稿日期：2017-08-18；接受日期：2017-11-28基金项目：广东省自然科学基金项目（2015A030313397） ，现代农业产业技术体系专项（CARS-25-C-04）磷是植物生长发育所必需的大量营养元素之一，在能量代谢、糖分代谢、酶促反应和光合作用等过程中起着至关重要的作用，且是核酸、植素和卵磷脂的重要组成成分，在很大程度上决定了作物的产量和品质（Lynch&Beebe，1995） 。目前已报道的高等植物中的磷转运蛋白基因主要有 4Research Progress on Thrips
5、 Megalurothrips usitatus（Bagrall） HUANGWei-kang，KONGXiang-yi*，KEYong-chun，WANGShuang，LIQiu-jie，FUQi-wei，WUQian-xing，LIUYong（SanyaInstituteofScienceandTechnologyforCropWinterMultiplication，Sanya572000，Hainan，China）Abstract：CowpeaisoneoftheimportantvegetableinwinterinHainanProvince.ThripsMegalurothrip
6、s usitatus（Bagrall）isthemajorinsectpestoncowpeaplant.Ithasinflictedasevereimpactoncowpeayieldandquality，andbroughtaboutgreateconomiclosses.Thispaperexpoundedthegeographicaldistribution，identificationmethods，hostanddamage，biologicalcharacteristicsandcontrolmethods，etc.，aimingatprovidingreferrencesfor
7、theeffectivecontrolofMegalurothrips usitatus（Bagrall）.Key words：Megalurothrips usitatus（Bagrall） ；Geographicaldistribution；Hostplant；Controlmethod2727研究论文中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES2018（2） ：27-33中国蔬菜学术论文下载 www. c n v e g . o r g体内运输的功能（Linetal.，2009） 。通过不同的生物信息学软件预测，PHT1 家族的磷转运蛋白在结构上具有高度的相似性（李立芹，2011）
8、。大多数植物的高亲和磷转运蛋白主要在根部表达，有的磷酸盐转运蛋白受缺磷诱导，有的则受菌根诱导，并且具有很高的特异性（Bucher，2007；Jainetal.，2007） ，这充分说明了根系对植物磷素吸收和利用的重要性。纳米技术是 20 世纪 80 年代末诞生并崛起的高科技，对世界经济、工业和人们的生活产生了非常重要的影响。随着纳米材料研究的深入，其在植物上的应用也越来越广泛。越来越多的研究表明，纳米材料能在一定程度上改善植株的生长发育及其对营养元素的吸收。喷施相同含硅量的纳米硅藻土、纳米二氧化硅后，苋菜干物质量分别比对照提高43.4% 和 14.9%，氮磷钾吸收总量分别提高 36% 和20%
9、（裴福云等，2015） 。纳米碳的加入还能提高土壤中碱解氮、速效磷、速效钾的含量，并促进玉米对 N、P、K 等养分的积累（王佳奇，2013） 。刘秀梅（2005）研究表明，纳米亚微米级复合材料能提高作物对褐潮土、红壤和风沙土中氮、磷、钾的吸收和利用，植株干质量及氮、磷、钾含量均显著高于对照。南方蔬菜生理与设施研究中心在前期关于纳米材料对叶用莴苣生长发育的生理研究中，发现纳米材料可以显著增加根系对 N、P、K、Zn 及地上部对 N、P、K、Ca 的吸收（李贵莲等，2015；苏蔚等， 2015） ， 并在此基础上进行了转录组测序（Wangetal.，2017） 。在分析转录组数据的过程中，发现与磷
10、转运蛋白相关的 unigenes 在处理中上调表达，因此本试验首先从叶用莴苣中克隆 LsPHT1 基因全长，对基因序列及其翻译的氨基酸序列进行分析；并对叶用莴苣进行纳米材料处理，结合半定量 PCR和实时荧光定量 PCR 技术检测纳米材料处理下LsPHT1 基因表达量，探讨 LsPHT1 参与叶用莴苣响应纳米材料的作用特性，以期为进一步研究纳米材料影响叶用莴苣生长发育的分子机理奠定基础。1 材料与方法1.1 试验方法供试叶用莴苣（Lactuca sativa L.）品种为耐抽薹意大利生菜，由广东省农业科学院蔬菜研究所提供，2015 年 10 月 13 日在华南农业大学园艺学院714 培养箱内催芽
11、；种子萌芽后播于装有珍珠岩的穴盘中，三叶一心时选择均匀一致的幼苗移栽至装有 30L1/2Hoagland 全营养液的水培箱中。供试纳米材料为广州市富阳环保科技有限公司和华南农业大学新肥料研究资源中心研制生产的纳米胶片，主要成份是 TiO2和 ZnO，涂布于塑料片上，面积为14cm12cm。试验按每升营养液中使用纳米胶片的面积设置2 个处理：CK，无纳米胶片（0cm2L-1） ；T，1/2片纳米胶片（2.80cm2L-1） 。每处理 18 株，3 次重复，随机排列。移栽后第 25 天，随机采集 3 株未经纳米处理的叶用莴苣植株，分别将叶片和根系用液氮处理（样品速冻 t 1min）后 -80冰箱保
12、存，用于 RNA 提取和基因克隆；纳米材料处理后第 2、5、10、16、22、28、31、34 天，分别于上午 9：00 随机选取 3 株叶用莴苣植株，分别将叶片、根系用液氮速冻后保存于 -80冰箱，用于目标基因的表达分析。1.2 试验试剂Trizol 试剂、所有引物合成及测序工作均由Invitrogen 公司完成；反转录试剂盒 PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser（PerfectReal-time） 、RACE 试剂盒 3 -FullRACECoreSetwithPrimeScriptRTase、DNAmarker、PMD18-T 载体、SYBRPr
13、emixExTaqMix 购自 TaKaRa 公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；用于DNA 扩增的 2SuperStarPCRMix 购自 Genestar 公司；其他试剂均为国产分析纯。1.3 总 RNA 提取及 cDNA 第一链合成采用 Trizol 法提取总 RNA，利用核酸蛋白仪Nanodrop2000 测定 OD260和 OD280，根据 OD260/OD280比值判断 RNA 的质量，采用琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 的完整性。以样品中的 1g 总 RNA 为模板，利用反转录试剂盒去除基因组 DNA 并反转录合成 cDNA，作为半定量 PCR 和实时荧光定量
14、 PCR（q-PCR）的模板。1.4 LsPHT1 基因克隆及序列拼接采用 RACE（rapidamplificationofcDNAends）法克隆 LsPHT1 基因全长 cDNA。通过转录组测序2828研究论文中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES中国蔬菜学术论文下载 www. c n v e g . o r g获得叶用莴苣磷转运蛋白基因的片段，根据此片段序列设计用于 3 RACE 的片段特异性引物（表 1） ，其余操作完全按照 RACE 试剂盒的操作手册进行。利用 DNASTAR 软件将扩增得到的目的基因片段进行拼接，获得全长 cDNA。根据 ORF 两端序列设计特异引物 P
15、HT1-F 和 PHT1-R，扩增该基因的编码区序列（codingsequences，CDs） ，PCR 扩增产物经回收、纯化，与 PMD18-TVector 连接，转化DH5 感受态细胞，蓝白斑筛选后选取阳性克隆，送赛默飞世尔科技（中国）有限公司测序。扩增结果测序后与拼接序列进行比对，最终证实获得叶用莴苣磷转运蛋白 LsPHT1 基因全长。表 1 试验所需引物序列引物名称引物序列（5 -3 ）用途GSP1TGGGATTCTTCTTTATGACGGTT3 端 RACE 克隆GSP2GTTCGCTCTCGCCATTCCTTA3 RACEOuterPrimerTACCGTCGTTCCACTAGTGATTT3 端 RACE 克隆3 RACEInnerPrimerCGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGGPHT1-FATGCCCCGCGAGCAATTGCAAGTGcDNA 全长克隆PHT1-RTGCGTATCCAACAAAAGTACATCALsPHT1-F1GACTCGTGGTGCGTTTAT半定量 PCRLsPHT1-R1CTGATGCCGCTTGTTTAGLsCAB-F1AGTCCTCCTGTTTCCCCTT半定量 PCRLsCAB-R1TTTCACCATCTCGTCATCC
