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1、实 用医学 杂志 2 0 1 3年第 2 9卷第 2 3期 i n A u s t r a l i a J N e p h r o l D i a l T r a n s p l a n t ，1 9 9 8 ， 1 3 ( 1 ) ：1 5 4 1 5 9 6 傅鹏， 董燕， 袁伟杰， 等 腹膜透析患者退出原因分析及处理 J 中国血液净化 ， 2 0 0 2 ， 1 ( 4 ) ： 1 4 1 6 7 P i r a i n o B， B a i l l e G R ，B e ma r d i n i J ，e t a 1 P e r i t o n e a l d i a l y s i
2、s r e l a t e d i n f e c t i o n s r e c o m m e n d a t i o n s ： 2 0 0 5 u p d m e J P e r i t D i a l I n t ，2 0 0 5， 2 5 ( 2 ) ： 1 0 7 - 1 3 1 8 刘鸿 ， 余理智 ， 戴光明 腹膜透析腹膜炎致病菌的耐药性分 析 J 中华医院感染学杂志， 2 0 0 3 ， 1 3 ( 3 ) ： 2 8 0 2 8 1 9 解晓珍， 潘绍武 ， 孔繁浩 ， 等1 6 6 2份腹膜透析液检出的菌 谱及其耐药状况 J 中华医院感染学杂志 ，1 9 9 6 ， 6
3、 ( 4 ) ： 2 4 9-2 5 0 1 0 朱红军， 柯永坚 ， 黄江玲， 等 离心法腹膜透析液的培养及其 病原菌分析 J 实用医学杂志， 2 0 1 1 ， 2 7 ( 6 ) ： 1 0 8 6 1 0 8 7 1 1 陈芳 ， 董骏武 ， 熊飞 培养阴性腹膜透析相关性腹膜炎的预 后探讨 J 中国中西医结合肾病杂志， 2 0 1 1 ， 1 2 ( 6 ) ： 5 1 9 3 93 3 5 21 1 2 朱伟平 ， 崔彤霞， 徐庆东， 等 腹膜透析相关性腹膜炎的菌谱 及其药敏分析 J 中国血液净化， 2 0 1 1 ， 1 0 ( 7 ) ： 3 5 7 3 5 9 1 3 文锐，
4、宁建平 腹膜透析相关感染性腹膜炎病原菌及耐药性 分析 J 肾脏病与透析肾移植杂志， 2 0 0 9 ， 1 8 ( 6 ) ： 5 3 3 5 3 6 1 4 吕鹏 腹膜透析相关腹膜炎致病菌及耐药性分析( 附 6 5例 报告) J 中国现代药物应用， 2 0 1 2 ， 6 ( 1 ) ： 8 2 8 3 1 5 李靖， 肖琼， 韩志武 ， 等 腹膜透析相关性腹膜炎发病因素及 耐药特征分析 J 西南国防医药， 2 0 1 2 ， 2 2 ( 4 ) ： 3 7 8 3 8 0 1 6 黄承国 腹膜透析相关性腹膜炎临床分析 J 中国实用医 药 ， 2 0 1 0 ， 5 ( 2 4 ) ： 1
5、0 7 1 0 8 1 7 唐勇 ， 胡庆 腹膜透析相关性腹膜炎治疗体会 J 华西医 学 ，2 0 0 9， 2 4 ( 7 ) ： 1 7 5 5 1 7 5 6 1 8 王秀芬， 甘红兵， 汪涛 腹膜透析相关性腹膜炎的临床分析 J 医师进修杂志 ， 2 0 0 3 ， 2 6 ( 1 2 ) ： 1 7 1 8 ( 收稿 ： 2 0 1 3 0 6 2 4 编辑 ： 王耀东 ) 3种方法提取外周血 D N A比较分析 范俊 丽 郑芳付 小曼 彭春 艳李聪 摘要 目的 ： 比较 P K法、 K A c法和 N a I 法提取外周血 D N A的差异 帮助临床研究选择更合适的 D N A 提取
6、方法。方法： 分别用 3种方法提取外周血 D N A， 比较各方法时耗、 花 费、 标本量及提取 D N A的浓度、 纯 度等 因素 ， 方法间差异采用非参数检验( 秩和检验) 。结果： P K法和 K A c 法获得 D N A浓度无统计学差异 ， 纯 度上 P K法更好 。 但 K A c法耗 时更短 ， 且成本 更低 ， 更 安全 ； N a I 法提取 D N A纯度 不 高， 但耗 时最短 ， 也 可 小 样本提取 D N A。结论 ： 从安全性、 耗时、 标本量及提取质量等方面比较 ， K A c法是较好的 D N A提取方法； N a I 法可用于快速提 取 关键 词P K法 ；
7、 K Ac法 ： Na I法； D N A D N A 是一类带有遗传信息的生物大分子 ， 普 遍存在于各种细胞中。这些遗传信息不断从亲代 遗传到子代 ， 决定子代的遗传性状。因为 D N A的 这一特性 ，对 D N A的研究广泛应用于各个领域 ， 包括疾病发生机制 、 诊断和治疗 ， 新基 因的分离 ， 活性多肽、 蛋白质和疫苗的生产等。随着技术的成 熟 对于 D N A的研究也到越来越深人 。快速、 经 济地从外周血或组织 中提取高产量 、高纯度的 D N A， 对于疾病的分子水平研究非常重要 。本研究 主要是 对 于实 验 室常用 的 3种 方 法 ： P K法 、 K A c 法 和
8、 N a I 法提取外周血 D N A进 行 比较 ， 旨在 帮助 不同实验选择最合适的D N A提取方法。 1材料 与方法 1 1 样本选择选取新鲜 E D T A N a抗凝静脉血 1 0份， 每份约 5 m L 。每份血分别用 3 种方法各提 d o i ： 1 0 3 9 6 9 j i s s n 1 0 0 6 5 7 2 5 2 0 1 3 2 3 0 5 5 作者单位： 武汉大学中南医院检验科 通信作者： 郑芳E - m a i l ： z h e n g f a n g w h u e d u a n 取 2份 D N A样本。最终获得 6 0份 D N A样本。 1 2 试
9、 剂 1 红 细胞 裂 解液 ： 1 细 胞 核裂 解液 ( p H 8 2 2 m o l L T r is H C I ， 0 5 m L ； 4 m o l L N a C 1 ， 1 0 0 m L ； 2 m m o l L E D T A， 0 4 m L ； 加 d H 2 O至 1 0 0 m L) ； 1 0 S D S； 2 0 m g mL蛋 白酶 K； 饱 和酚 ； 酚 氯仿 ( 1： 1 V V) ； 7 0 乙醇 ； 1 细胞核裂解液 ( 1 0 S D S ， 5 0 ml ； 5 M N a C 1 ， 2 0 mL ； 0 5 m mo l L E D T A
10、， 0 2 mL ； p H 8 2 1 m o l L T r i s H C 1 ， 5 0 mL ； 加 d H 2 O至 1 0 0 m L ) ； P P S醋酸钾缓冲液( K A c ， 2 9 4 4 2 g ； 冰醋酸 ， 1 1 5 m L； 加 d H 2 0至 1 0 0 mL ) ； 纯异丙醇 ； 3 7 异丙醇； 6 m o l L N a I 溶液等。 1 3 D N A提取 1 3 1 P K法提取 D N A 2 - 3 取 1 m L新 鲜 E D T A N a 抗凝血于 1 0 m L离心管中， 加 3 倍体积的 1 红 细胞裂解液， 混匀 ， 冰上静置
11、3 0 m i n ， 每 l 0分钟摇 匀 1 次。 直至溶液变透明。4 C 1 0 0 0 0 r m i m离心 1 0 m i n 小心去上清液。 沉淀中加 3 4 m L l x 细胞核 裂解液 用枪头打匀 2 O次混匀 ， 然后加 3 4 0 lx L 1 0 S D S ， 摇匀 ， 至出现黏稠透明状。加 4 0 L 2 0 mg mL蛋 白酶 K( P K ) ， 摇匀。 3 7消化 6 h以上或过 夜。加等体积饱和酚， 轻摇混匀， 室温 1 0 0 0 0 r m i n 离心 1 0 m i n 。 小心移上清至另一离心管 ， 加等体积 酚 氯仿 异戊醇( 2 5： 2 4
12、： 1 V V V ) 混匀 ， 室温 1 0 0 0 0 r m i m离心 1 0 m in 。小心移上清 ， 若上清不 清亮透明， 则用等体积氯仿再抽提一次。 将上清移 人另一离心管中， 加二倍体积无水乙醇， 摇匀 ， 见 白色絮状 D N A 。离心去上清后 ， 7 0 乙醇洗涤( 即 加人 1 mL 7 0 乙醇 1 2 0 0 0 r m i m离心 1 0 m i n ) 二 次， 室温干燥 5 m i m， 再将 D N A溶于 3 0 1 x T E 中， 4溶解过夜保存。 1 3 2 K A c法提取 D N A - 6 取 1 mL新鲜 E D T A N a 抗凝血于
13、1 0 m L E p 管中 加 3 倍体积的 1 红细 胞裂解 液 ， 混匀 ， 冰上静置 3 0 mi n ， 每 1 0分钟摇 匀 1 次 ， 直至溶液变透明。 4 c C 1 0 0 0 0 r m i n离心 1 0 mi n ， 小心去上清液。沉淀中加 1 m L l x 细胞核裂解液， 用枪头打匀 2 O 次混匀 ， 5 4 6 0。 【= 放置 1 2 h 。将 裂解好 的溶液置 于 4 冰箱预冷 1 0 m i n ， 按 3： 1 的比例加入 P P S ( 醋酸钾缓冲液) ， 即 3 3 5 L ， 4 1 0 0 0 0 r m i n离心 1 5 m i n ， 如有
14、少量 的蛋 白质还没 有沉淀下来 ， 转移到新 E p管， 重复离心 1 次。 将上 清转移至新的 E p管， 按 1 ： 1比例加入纯异丙醇 ， 上下颠倒 l 02 0次直至能看见絮状核酸沉淀 ： 1 0 0 0 0 r m i n 离心 1 0 m i n 。 去掉上清液， 7 0 乙醇洗涤 ( 即加人 1 m L 7 0 乙醇 1 2 0 0 0 r m i n离心 1 0 ra i n ) 2次， 室温干燥 5 m i n ， 再将 D N A溶于 3 O此 l x T E 中 ， 4溶解过夜保存 。 1 _ 3 - 3 N a I 法提取 D N A 取 1 0 0 t x L新鲜 E D T A N a抗 凝 血 置 E p管 中 ， 加 d d H O 2 0 0 L， 摇 匀 约 2 0 s 。 加 6 m o l L N a I 2 0 0 I L L ， 缓慢倒置摇匀约 2 0 S 。 于管内加氯仿 异戊醇( 2 4： 1 ) 4 0 0 tx L ， 摇匀约 2 0 S ， 1 2 0 0 0 r mi n离心 1 2 mi n 。 吸取上层水相约 3 6 0 L 置一新 E p 管中， 加纯异丙醇 2 0 0 Ix L ， 摇匀约 2 0 s 。 室温
