《脑血管疾病患者载脂蛋白E基因型分布以及相关研究（毕业设计-内科学专业）》由会员分享，可在线阅读，更多相关《脑血管疾病患者载脂蛋白E基因型分布以及相关研究（毕业设计-内科学专业）（49页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、 目录中英文缩略词表. 5 中文摘要. 6 Abstract. 8 1 前言. 10 2 资料与方法. 12 2.1 研究对象的选择. 12 2.2 资料收集和标本采集. 13 2.3 试剂与仪器设备. 13 2.4 实验方法. 14 2.5 NIHSS评定 . 19 2.6 统计学处理. 20 3 结果. 20 3.1 三组人群的ApoE基因型和基因频率. 20 3.2 CI组、ICH组与对照组生化指标比较. 21 3.3 不同ApoE基因型的脑血管疾病患者NIHSS评分. 22 3.4不同ApoE基因型的脑血管疾病患者hs-CRP的比较 . 23 4 讨论. 24 4.1 三组人群的Apo
2、E基因型和基因频率分布特点. 24 4.2 CI组、ICH组血糖和血脂改变. 25 4.3 CI组和ICH组基因型与神经功能缺损（NIHSS评分）间的关系25 4.4 ApoE基因型与hs-CRP 的关系 . 27 5 结论. 28 6 参考文献. 28 附录一.321 致 谢. 33 综 述. 34 2 中英文缩略词表Abbreviation英文缩略词ApoECVD英文全称 中文全称apolipoprotein E genecerebrovascular diseasecerebral infarction载脂蛋白E脑血管疾病脑梗死CIICH intracerebral hemorrhage
3、atheroselerosis脑出血AS 动脉粥样硬化超敏C反应蛋白hs-CRPNIHSShigh sensitive C-reactive proteinThe National Institutes of Health 美国国立卫生院卒中量表Stroke ScaleTC total cholesterol 总胆固醇TG triglycerides 甘油三酯HDL-CLDL-CGluhigh density lipoprotein cholesterollow density lipoprotein cholesterolglucose高密度脂蛋白胆固醇低密度脂蛋白胆固醇血清葡萄糖CM ch
4、ylomicrons 乳糜微粒VLDL-C very low density lipoprotein 极低密度脂蛋白cholesterol3 脑血管疾病患者载脂蛋白E基因型分布以及相关研究中文摘要目的 1.研究脑梗死和脑出血患者载脂蛋白E(ApoE)基因多态性分布特点。2.探讨脑梗死和脑出血患者ApoE基因型与神经功能缺损（NIHSS评分）的关系。3.探讨脑梗死和脑出血患者ApoE基因型与血清hs-CRP含量有无关联。方法 收集脑梗死患者108例（其中急性脑梗死70例，非急性脑梗死38例）、脑出血患者78例和健康对照者76例，利用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)，测
5、定其ApoE基因型；采用生化全自动仪分别对总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)水平、血糖（Glu）水平和血清hs-CRP水平等进行测定；对所有脑梗死患者入院时、入院后1周和2周进行神经功能缺损（NIHSS评分）评分，脑出血患者入院时评分。结果 1.脑梗死患者2和4的频率分别为6.9%和9.7%，而对照组分别为19.1%和3.9%，差异均有统计学意义(P0.05)。2.1.2 入选标准所有CI和ICH患者均经头部CT和（或）MRI证实，诊断符合全国第四届脑血管病会议修订的诊断标准2.1.3排除标准11。正常对照组既往身体健康。（1）外伤性脑出
6、血。（2）蛛网膜下腔出血。（3）发病后行微创或者其他外科治疗者。（4）肿瘤、药物、血液病所致的脑出血者；（5）短暂性脑缺血发作者；（6）肿瘤、药物、血液病所致的脑出血者；（7）继发性血脂异常者(包括胰腺炎、甲状腺疾病、高血钙)；（8）经检验证实由脑肿瘤、脑外伤、脑寄生虫病、代谢障碍引起的脑栓塞者；（9）合并有肝、肾、造血系统和内分泌系统等严重原发性疾病，精神病患者。冠心病、合并周围血管疾病或周围血管栓塞性疾病者、大动脉炎，血液病、结核、恶性肿瘤及严重肝肾功能不全者。入院前一周内使用降脂和降糖等药物者。（10）患者或法定代表人拒绝参与调查。10 2.2 资料收集和标本采集（1）一般资料登记：登记
7、住院患者的姓名，年龄，性别，发病时间，头颅 CT及 MRI 结果，检查了解有无糖尿病、高血压病史；在入院时、1 周时和 2 周时选用 NIHSS评分标准评价神经功能缺损程度。（2）所有被检查者均隔夜禁食 12h，次日清晨抽取肘静脉血 10mL，其中一部分血液标本用于生化检测（包括肝、肾功能，血糖、血脂，超敏 C 反应蛋白），余加入EDTA-Na2抗凝,-20保存，以备基因检测。2.3 试剂与仪器设备2.3.1主要试剂全血DNA抽提试剂盒（Takara）、DL2000 大连宝生物工程有限公司6loading buffer、20bpDNA Marker引物 美国Invitrogen生物技术公司美国
8、Promega公司sigama 公司BSA、CfolTEMED琼脂糖 BIOWEST公司丙烯酰胺DMSOSunshine 公司生工生物技术有限公司国药集团过硫酸铵、乙醇11 2.3.2. 主要仪器设备PCR仪、离心机、移液器振荡器德国eppendorf公司Qilinbeier公司灭菌锅 Hirayama公司电凝胶成像系统电泳仪Tanon Gis System公司美国Bio-Rad公司2.4 实验方法2.4.1 DNA提取(1) 按处理样品数准备1.5ml离心管，并各加入GenTLE Solution I 500ul；(2) 把混合均匀的100ul血液，加入到分装好的GenTLESolution
9、的离心管中，立即震荡数秒钟；(3) 室温放置10分钟以上，然后在室温条件下12000rpm离心5min；(4) 用移液枪小心除去管中溶液，此时沉淀看不到，紧贴在离心管外侧的内壁上，除去溶液时，请一定注意枪头不要碰到离心管外侧的内壁，插到离心管内侧的底部，注意不要吸走沉淀物；(5) 加入1ml的GenTLE Solution，此时GenTLE Solution应沿着离心管内侧的内壁加入到离心管中；(6) 轻柔地上下颠倒离心管数次(剧烈震荡将影响收量和纯度)，室温 12000rpm离心2分钟，用移液枪小心的除去上清溶液；(7) 向离心管中加入GenTLE Solution500ul，轻微震荡10秒
10、钟充分混合；(8) 室温12000rpm以上离心 5分钟，把上清溶液移至另一个新的离心管中；(9) 加入等体积（500ul）的异丙醇，上下轻柔颠倒数次，均匀混合。(10) 4下 12000rpm 转速离心 5 分钟，小心除去上清溶液（GenTLE Solution中含有影响酶的反应物质，所以一定要除净上清溶液，不要吸走沉淀。(11) 加入1ml的70%乙醇清洗沉淀，4C、12000rpm离心5分钟，弃上清，空气中干燥沉淀约1520min；12 (12) 依据沉淀基因组DNA的量，用50l100lddH2O溶解DNA。2.4.2 DNA琼脂糖电泳(1) 配胶：以 0.7%1.3%的琼脂糖胶均可，
11、称取相应含量的琼脂糖，与相应体积的 0.5TBE 溶液混合，微波炉加热 12 分钟至胶完全熔化（0.5TBE 溶液由5TBE储存液稀释而来）；(2) 灌胶 待溶化的胶冷却（但没有凝固）时加溴乙锭溶液（EB）3.5l摇晃均匀，倒入水平槽中（如果需要做切胶回收，应视具体情况增加其厚度）；(3) 上样准备：待琼脂糖胶凝固后，放入0.5TBE缓冲液中，将抽取的DNA溶液5l混合好溴酚蓝loading buffer，加入加样孔，120V电泳20分钟；(4) 电泳完毕，在紫外凝胶成像仪上观察，拍照。应能看到抽取的基因组DNA。（注：EB见光分解，有毒性，能诱发DNA变性，当进行所有涉及EB的操作时请务必戴
12、上手套）。见图12.4.3 ApoE PCR扩增反应PCR 引物对序列为：5TCC AAG GAG CTG CAG GCG GCG CA 35ACA GAA TTC GCC CCG GCC TGG TAC ACT GCC A 3特异性扩增产物为227个碱基，PCR反应体系（以25l体系为例）：Premix Ex Taq 酶PrimerR/F12.5l各1l6lddH2O二甲亚砜（DMSO）DNA 模板2.5l3lPCR 反应条件：955min(9530s6530s72)循环45次30s7210min取产物5l进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，以DNALadder2000(Takara)为marker，120V20min，特异性扩增产物227bp。见图2。2.4.4 PCR扩增产物限制性酶切酶切反应体系（20l）：13 ddH2O 2.5lPCR 扩增产物乙酰化牛血清白蛋白(BSA)10buffer15l0.2l(终浓度 0.1ug/ul)2l限制性内切酶CfoI 0.5l(5units)混匀后4000rpm离心5秒，使所有液体集中到EP管底部，37消化3.55小时。2.4.5 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳观察酶切片段的大小（Bio-Rad Miniproteinsystem）反应终止后，酶切产物12%非变性聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳，胶板厚度1mm，电泳缓冲液为1TBE（由5
