高效液相色谱法测定双黄连注射剂中黄芩苷的方法分析

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1、高效液相色谱法测定双黄连注射剂中黄芩苷的方法分析高效液相色谱法测定双黄连注射剂中黄芩苷的方法分析双黄连注射剂是近年来研制的中药制剂，在临床上主要用于急性上呼吸道感染、急性支气管炎、急性扁桃腺炎、肺炎及急性尿路感染等，其疗效确切，安全，应用十分广泛。双黄连注射剂由金银花、黄芩、连翘 3 味中药提取制成，主要成分为黄芩苷、绿原酸、连翘苷等1。药理学研究已证实黄芩苷具有抑菌、清热、降压、镇静、利尿、利胆、抗炎、抗变态反应、解毒等作用;绿原酸具抗菌消炎、清热解毒等作用;而连翘苷则具有较强的抑菌、抗病毒的活性。双黄连注射剂黄芩苷含量测定的方法主要有高效液相色谱法、薄层扫描法、紫外分光光度法等，高效液相色

2、谱法具有分离效能高、分析速度快且精准等特点，适合中药成分的多样性及复杂性，在双黄连制剂的质量控制上应用也最多。本文通过优化色谱条件测定黄芩苷的含量，以期为进一步研究双黄连注射剂中绿原酸及其它成分打下基础，为双黄连注射剂工艺研究和质量控制提供理论基础。1 仪器与试剂1.1 仪器 Agilent1100 高效液相色谱仪(美国 Agilent 公司);TU-1800 紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责公司);KQ-100 型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);电子天平(上海精科天平);予华 SHZ-D()循环水式真空泵(河南省巩义市英峪予华仪器厂);Diamonsil(钻石)C18 色谱

3、柱(5m，4.6mm150mmCat.no：9990Ser.no：8011571DikmaTechnologies)。1.2 试剂双黄连注射液(批号 Z23021166 黑龙江乌苏里江佳大制药有限公司);黄芩苷化学标准品(批号 110715-200514,中国药品生物制品检定所);色谱甲醇(天津大茂化学试剂厂);分析纯甲醇(天津市北方天医化学试剂厂);磷酸(河北省保定化学试剂厂)。2 方法与结果2.1 色谱条件 Diamonsil(钻石)C18 色谱柱(5m，4.6mm150mm),流动相为 A-甲醇(色谱纯)：B-蒸馏水(5050)，流速为 1.0ml/min，检测波长为 326nm，进样量

4、 20l。其分离色谱见图 12。2.2 溶液的制备2.2.1 标准品溶液的配制精密称取黄芩苷标准品 0.005100g 至 50ml 容量瓶中，用甲醇(分析纯)定容至刻度，超声至其完全溶解。配制成浓度为 0.102mg/ml 的储备液放入冰箱，低温储存。2.2.2 供试品溶液的配制用 0.1ml 的移液管从双黄连注射液中精密吸取 0.05ml 至 10ml容量瓶中，用甲醇(分析纯)定容至刻度，超声 10min 使溶解。再用 0.45m 的滤膜过滤至用铬酸洗液浸泡 3h 并干燥好的 10ml 比色管中，扭紧塞子。2.3 线性关系考察精密量取浓度为 0.102mg/ml 黄芩苷标准品储备液0.5，

5、1，2，4，6，8ml 分别至 10ml 容量瓶中，用甲醇(分析纯)定容至刻度，配制成浓度为 5.1，10.2，20.4，40.8，61.2，81.6g/ml 的一系列标准溶液后，再用 0.45m 的滤膜过滤至用铬酸洗液浸泡 3h 后干燥好的 6 支 10ml 比色管中，扭紧塞子。按上述色谱条件进行测定，每个浓度的黄芩苷标准液测 3 次。根据 3 次峰面积的平均值，求黄芩苷的标准曲线。结果见表 1，黄芩苷在 5.181.6g/ml 浓度范围内呈良好线性关系。回归方程为Y=41.409X-132.35，r=0.9998。2.4 加样回收率测定用 1.0ml 的移液管从双黄连注射液中精密吸取 1m

6、l 至 100ml 容量瓶中，用甲醇(分析纯)定容，并超声 10min 使其完全溶解。从中吸取 5ml 至 10ml 容量瓶中，共 5 份，各精密加入黄芩苷标准品储备液0.051，0.102，0.204，0.306，0.357，0.510mg，用甲醇(分析纯)定容至刻度，并超声10min 使其完全溶解，按上述色谱条件进行测定，根据峰面积，计算黄芩苷含量，并计算黄芩苷的平均加样回收率。结果见表 2。表 1 黄芩苷的线性关系考察实验数据表 2 黄芩苷的加样回收率实验结果2.5 精密度实验取双黄连注射液 1 支，根据供试品溶液的配制法配制样品溶液 1 份，按上述色谱条件进行测定，共进样 5 次。结果

7、见表 3。表 3 黄芩苷的精密度实验结果2.6 重现性实验取同一批号双黄连注射液 5 支，根据供试品溶液的配制法配制样品溶液 5 份，按上述色谱条件进行测定。结果见表 4。表 4 黄芩苷的重现性实验结果2.7 稳定性实验根据供试品溶液的配制法配制样品溶液一份，在室温下放置，分别于0，3，6，9，12h 时按上述色谱条件测定一次峰面积，实验结果 RSD=1.22%，表明黄芩苷在12h 内稳定，结果见表 5。表 5 黄芩苷的稳定性实验结果2.8 样品含量测定根据供试品溶液的配制法配制样品溶液，按上述色谱条件进行测定。经实验测得双黄连注射液中黄芩苷的含量为 7.1mg/ml。结果见图 12。3 讨论

8、双黄连注射剂的不良反应源自中成药的复杂成分，如金银花中所含有的绿原酸和异绿原酸，不仅具有抗菌抗病毒作用，又具有致敏原作用，可引起变态反应，是引起过敏反应的主要原因之一。童路2报道双黄连针剂引起的过敏反应与黄芩苷有关，毒性反应与黄芩中的另一种成分有关。黄芩苷与绿原酸的极性相差极大，在质量标准中也只规定两者含量分别测定，用 HPLC法同时测定两者含量，多采用梯度洗脱法逐渐降低流动相极性的方法,而吸收波长一般选择326nm，以提高绿原酸的灵敏度。黄芩苷的 HPLC 测定，其流动相有甲醇水冰醋酸(5501);甲醇水磷酸(50500.2);异丙醇甲醇3%的醋酸(53065);甲醇0.5%三乙胺(7525)系统。而在 2005 年版中国药典中黄芩苷的色谱条件与系统适用性试验为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以甲醇水冰醋酸(50501)为流动相，检测波长为 274nm，理论塔板数按黄芩苷峰计算应不低于 1500。但我们在实验条件摸索过程中发现，流动相采用甲醇水(用 10%磷酸调节 pH 至 2.7)，比例定为 5050，黄芩苷与注射液中其它组分分离良好，并且能减少磷酸盐对泵的侵蚀等。双黄连注射剂中主要成分分析方法报道很多35，但制剂中其它成分分析方法少见报道，本文旨在通过黄芩苷的分析测定，进一步找出其中各种成分的分析、分离方法，探讨双黄连注射剂不良反应的原因。