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1、酒精性及非酒精性脂肪性肝炎中的凋亡酒精性及非酒精性脂肪性肝炎中的凋亡1. 摘要摘要酒精性肝病（alcohol liver disease，ALD）及非酒精性脂肪性肝病（nonalcohol fatty liver disease，NAFLD）是最常见的慢性肝病，均可发展为肝硬化及晚期肝病。ALD 和 NAFLD 在初始肝内脂肪堆积阶段具有许多相同的病理生理机制，从单纯性脂肪变发展到脂肪性肝炎过程中，线粒体功能障碍及活性氧的产生均发挥重要的作用，ALD 及 NAFLD 中组织损伤的发病机理尚不十分清楚，对相关机制的研究重要的临床意义，现阶段对两病的治疗方法很局限，通过对发病机制的研究来发现新的治
2、疗方法。我们主要对 ALD 和 NAFLD 发病过程中的肝细胞凋亡以及激发凋亡过程的亚细胞及分子机制进行研究。2. 引言引言2.1. 酒精性肝病及非酒精性脂肪性肝病酒精性肝病及非酒精性脂肪性肝病酒精性肝病（ALD）及非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是世界范围最常见的慢性肝病 1;2 ，均可发展为晚期肝病3;4。ALD 及 NAFLD 通过组织病理很难区分，都经历从单纯性脂肪肝、脂肪型肝炎、Mallory 小体、肝细胞气球样变发展为进展期肝纤维化及肝硬化5。ALD 及 NAFLD 在发病的第一阶段脂肪积聚过程中有许多相同的病理生理机制6 。在单纯性脂肪肝到脂肪性肝炎过程中，线粒体功能障碍及活性氧
3、的产生发挥重要的作用 7;8，然而 ALD 及 NAFLD 与组织损伤之间的发病机制尚不十分清楚。2.2.凋亡机制凋亡机制凋亡是细胞死亡的一种形式，以程序性细胞核及细胞破裂为特征。凋亡细胞破裂成为细胞膜包裹的凋亡小体，被巨噬细胞吞噬。凋亡受两个基本通路调控9;10（图 1）：一种为细胞表面死亡受体介导的外源性途径；另一种是以细胞器为基础的内源性途径。外源性途径由死亡受体如 CD95（APO-1/Fas） 、TNF-R1、TRAIL-Rs 等激发。当这些受体与他们的天然配体结合后会触发细胞内级联反应，激活死亡介导的蛋白酶，尤其是细胞凋亡蛋白酶（caspase） 。内源性途径可被几种胞内细胞器所激
4、发。溶酶体通透性增加、内质网应激、细胞核内 DNA 断裂及线粒体功能障碍均可触发凋亡 11;12;13 。在肝细胞内，线粒体功能障碍通过放大凋亡信号以及将两条通路整合为最终共同通路来发挥重要作用14;15。线粒体功能障碍导致一些促凋亡蛋白释放到细胞质内，其中包括细胞色素 C，与胞质中的凋亡蛋白激活因子(apoptotic-protein activation factor-1，Apaf-1)及caspase 9 共同组成凋亡体。该复合体激活下游效应分子caspase 3、6 和 7，最终导致凋亡改变11。线粒体功能障碍受 Bcl-2 家族调控，包括抗凋亡因子（Bcl-2，Bcl-xL）及促凋亡
5、因子（Bax，Bak）16。图 12.3.凋亡及肝脏凋亡及肝脏肝细胞凋亡在肝脏疾病发生发展过程中的重要机制14;17;18;19;20;21。细胞修复、炎症、再生及纤维化均可被凋亡所激发14;17，其中肝纤维化最为严重，进展性肝纤维化可导致肝硬化，也可伴随门脉高压、肝衰竭及肝细胞癌的发生。实验和人体研究均表明肝纤维化形成与肝细胞凋亡有关22。研究报道，肝细胞凋亡的减弱能够减少胆汁淤积动物模型肝纤维化的形成23;24。肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSC）吞噬凋亡小体导致 HSC 活化，可能为肝细胞凋亡促进肝纤维化形成的机制25。同 NAFLD 相似，在丙型肝炎病毒（
6、hepatitis C virus，HCV）感染的患者中，肝细胞凋亡的程度与纤维化严重程度相关26;27。凋亡小体被认为虽然多年前研究发现 ALD 及 NAFLD 患者组织病理中会出现致密的凋亡小体，但是直到近几年才发现凋亡在炎症及纤维化过程中发挥重要的作用（图 2） 。因此我们阐述凋亡在ALD 及 NAFLD 发病过程中的作用及肝细胞凋亡激发过程中的亚细胞及分子机制。图 23. ALD 中肝细胞凋亡中肝细胞凋亡尽管经过多年的研究，但是 ALD 的发病机制仍知之甚少1;3;28。慢性酒精消耗会导致肝脏脂肪变，部分患者会发展成为脂肪性肝炎甚至肝硬化29;30。脂肪酸合成增加、线粒体 氧化减少等一
7、系列脂类代谢改变将导致脂肪肝，而疾病进展过程中的关键机制尚不十分清楚。大量研究表明，肝细胞凋亡可能为酒精诱导的肝损伤的主要机制31;32;33。近年研究证实，肝细胞凋亡为 ALD 的主要病理特点。两项早期研究发现，应用 TUNEL 实验方法在 ALD 患者活检肝组织中可观察到肝细胞凋亡34;35。这些结果在后续研究中得到证实和延伸。采用 TUNEL 及免疫组织化学方法观察凋亡蛋白酶激活，Natori 等36证实 ALD 患者肝细胞凋亡程度与疾病的严重程度相关，肝细胞凋亡在胆红素、AST 较高患者及脂肪型肝炎 4 级患者中更加明显。Ziol 等37研究发现 ALD患者肝组织凋亡指数与 Maddr
8、eys 判别函数、腹水及血清胆红素水平相关。Ribeiro 等38研究表明，细胞凋亡与疾病组织学相关，包括炎症程度及纤维化阶段。体内外研究均表明酒精暴露将会导致细胞凋亡的增加。通过喂食酒精建立小鼠及大鼠 ALD 动物模型发现凋亡从腺泡 3 带延伸到腺泡2 带33;39。人类及大鼠肝细胞体外实验发现，酒精诱导的肝细胞凋亡具有剂量依赖性40。3.1.ALD 的内源性凋亡途径的内源性凋亡途径在酒精诱导的肝细胞凋亡过程中可能发挥作用的机制有氧化应激导致的线粒体功能障碍及死亡受体介导的细胞凋亡。酒精诱导的肝损伤与活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生增多有关，ROS 包括超
9、氧自由基（O2-）及氢氧自由基（OH-） 。ROS 的潜在来源包括酒精诱导的Kupffer 细胞及肝细胞中细胞色素 P450 2E1（CYP2E1）7。ROS 产生过多会导致脂质、蛋白质及 DNA 的氧化损伤41。多不饱和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acids，PUFA）主要存在于细胞膜，由于其分子结构中富含烯丙氢，极易被ROS 损坏41。线粒体膜中含有大量包括 PUFA 在内的磷脂，导致 ROS 极易破坏线粒体。线粒体功能障碍会导致 ROS 产生，将通过某些机制直接诱导细胞凋亡或通过 Fas 配体诱导凋亡42;43;44。ROS 也能通过诱导线粒体通透性转换孔的开放或
10、诱导 Bax 从胞质向线粒体的转运促进线粒体通透性转换（mitochondrial permeability transition，MPT）45。这将导致线粒体通透性增加，释放细胞色素 C 从而激发细胞凋亡的一系列级联反应。当损伤十分严重，大多数线粒体受损，ATP 耗尽，会导致凋亡向肿胀样坏死转变46。在 ALD 中，与氧化应激在肝细胞凋亡中的作用相似，Kurose 等43证实谷胱甘肽缺乏小鼠 ALD 模型中肝细胞凋亡增多，抗氧化治疗会减少模型小鼠的肝细胞凋亡。Chen 等研究发现，将人细胞系暴露于花生四烯酸后过表达 CYP2E1 会增加脂质过氧化及细胞凋亡47。3.2.ALD 的外源性凋亡途
11、径的外源性凋亡途径酒精诱导的肝细胞凋亡与死亡受体诱导的细胞凋亡相关，尤其是 Fas/Fas 配体（Fas-ligand，FasL）及 TNF 受体（TNF-R1）1/TNF- 系统。Taieb 等研究报道，ALD 患者血清中膜型 Fas 及 FasL 表达水平增高48。其他学者发现血清 TNF- 也增高，可作为酒精依赖组死亡率的预测指标49;50。在 Natori 的研究中36，ALD 患者肝细胞内 Fas 受体高表达，Ribriro 等发现 Fas 及 TNF-R1 均高表达38。前面提到，氧化应激与 FasL 的表达增多有关。Galle 等发现 ALD患者 FasL mRNA 表达增多。由
12、于肝细胞也表达 Fas 受体，在酒精性肝损伤中，肝细胞坏死能够导致肝细胞本身旁分泌及自分泌。实验研究证实死亡受体介导的凋亡在 ALD 发病过程中发挥作用。Limuro 等52发现 TNF- 能够减弱持续酒精胃内喂养的大鼠 ALD 模型的肝损伤。然而 Yin 等采用持续肠内酒精喂养对 Limuro 的实验进行后续研究证实 TNF-R1 敲除小鼠酒精诱导的脂肪变及肝脏损伤程度减轻53。Pastorino等研究证实 ALD 发生过程中 TNF- 对肝脏的损伤作用部分通过 p38 MAPK 信号转导通路中 MPT 介导54;55。Rpdrigue 等56近期研究发现暴露于药物浓度酒精中的人类及大鼠肝细
13、胞 TNF-R1 的表达水平升高。这些结果表明酒精有调控肝细胞内 TNF-R1 表达的直接作用，然而，酒精诱导TNF-R1 产生的亚细胞机制仍未知。4. NAFLD 中的肝细胞凋亡中的肝细胞凋亡肥胖是一种严重的公共健康问题，与之相关的代谢综合征是 NAFLD 发生发展过程中的主要危险因素，NAFLD是美国及其他一些国家最常见的慢性肝病2;8。NAFLD 是一种临床病例综合征，包括单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎及肝硬化等一系列肝脏损伤57。非酒精性脂肪性肝炎（Nonalcoholic steatohepatitis，NASH）是 NAFLD 中比较严重的阶段，从广义上讲是指肝脏病理有脂肪变、炎发病机制
14、症及不同程度的纤维化，且无过量饮酒史58。NASH 的尚不十分明确。近年来有观点表明 NASH 的发生发展过程为“二次打击”的过程59;60。第一次打击是肝脏脂肪变的形成。胰岛素抵抗在 NAFLD 患者中普遍存在，被认为在肝脏脂肪堆积过程中发挥关键作用61;62。胰岛素抵抗及高胰岛素血症会导致游离脂肪酸（free fatty acids，FFA）的吸收、合成、分解及分泌等肝内代谢途径发生改变61;62。虽然这些途径之间的关联还未阐明，但是最终会导致肝细胞内脂肪酸堆积，肝脏对第二次打击更加易感，第二次打击会触发炎症反应及进展性肝损伤。第二次打击的本质机制还不清楚，但是对这些过程的认知具有重要的生
15、物学意义，将为NASH 的治疗提供新的治疗靶点。新的研究表明，肝细胞凋亡可能为 NAFLD 进展为NASH 过程中二次打击的关键步骤63。应用 TUNEL 实验方法及免疫组织化学观察 NAFLD 患者激活型 caspase 3，我们证实肝细胞凋亡是 NAFLD 的显著病理特点27。此外，我们还发现肝细胞凋亡与 AST/ALT 比值、炎症程度及纤维化阶段正相关27。随后，Ribeiro 等采用相似的方法证实了我们的观点38。在体内 NAFLD 动物模型及体外脂肪变肝细胞模型均证实脂肪酸堆积会导致肝细胞凋亡。在蛋氨酸-胆碱缺乏（methionine choline deficient，MCD）饮食
16、诱导的NAFLD 动物模型中，在饮食诱导早期即可观察到肝细胞凋亡。我们发现高碳水化合物饮食诱导的小鼠 NAFLD 模型Fas 诱导的肝细胞凋亡敏感性增加，NAFLD 的主要特点包括肥胖、胰岛素抵抗、高胰岛素血症、血清 FFA 增高及肝脏脂肪变性64。对缺乏瘦素的 NAFLD 基因模型 ob/ob 小鼠的研究发现细胞凋亡的内源性及外源性途径中的不同信号分子表达明显增多，而肝细胞本身凋亡增加并不明显65。这一模型的特点是缺乏纤维化阶段66。在体外将人类肝细胞暴露于长链脂肪酸导致剂量依赖性细胞凋亡64。4.1.NAFLD 的内源性凋亡途径的内源性凋亡途径FFA 在非脂肪组织如肝脏内积聚将会进入非氧化途径来触发肝脏损伤及凋亡。一些假说机制表明可能会在 FFA诱导的凋亡过程中发挥作用。其中包括 ROS 的产生、溶酶体途径及死亡受体介导的途径。Seki 等67在 N
