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1、1饲料及饲料原料中黄曲霉毒素B1的快速筛查 胶体金免疫层析法江西省地方标准编制说明一、标准制定意义一、标准制定意义（一）介绍（一）介绍黄曲霉毒素属于二呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，其分子结构中含有 1 个二呋喃环和 1 个 氧杂萘邻酮（香豆素）环。黄曲霉毒素难溶于水、己烷、石油醚，易溶于甲醇、乙醇、氯 仿、二甲基甲酰胺等有机溶剂。在中性溶液中较稳定，在强酸性溶液中稍有分解，易被碱 或强氧化剂破坏，在 pH 值 910 的强碱溶液中会迅速分解成无毒的盐。纯品为无色结晶， 耐高温，分解温度为 268，紫外线对低浓度黄曲霉毒素有很强稳定作用。现已分离出 AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFB2a、
2、AFG2a、AFM1、AFM2、AFP1等 18 种之多，其中以 AFB1的毒性和致癌性最强。黄曲霉毒素的产毒菌广泛存在于花生、玉米、麦类、稻谷等粮食作物的籽粒及核桃、 杏仁等干果、禽蛋、肉、甘薯、大豆粕、奶及奶制品中。对动物有剧烈急性毒性和明显慢 性毒性，具有很强致突变、致畸和致癌作用。AFB1是迄今为止人类所知的毒性和致癌性最 强的物质之一，其急性毒性约为三氧化二砷的 68 倍、氰化钾的 10 倍。其损害肝脏，容易 引发肝炎、肝硬化、肝坏死等病症。亚洲和非洲的疾病研究机构的研究表明，食物中黄曲 霉毒素与干细胞癌变呈正相关性，长时间食用含低浓度黄曲霉毒素的食物被认为是导致肝 癌、胃癌、肠癌等
3、疾病的主要原因。黄曲霉毒素在体内还具有一定的蓄积性，长期摄入低 剂量的黄曲霉毒素能够大大增加患肝癌的几率。此外，黄曲霉毒素与其他致病因素（如肝 炎病毒等）对人类疾病的诱发具有叠加效应，其细胞毒作用可干扰信息 RNA 和 DNA 的合 成，进而干扰细胞蛋白质的合成，导致动物全身性损害。（二）背景（二）背景据联合国粮农组织（FAO）统计，全世界每年谷物产量的 25%受到真菌毒素不同程度 的污染。随着饲料工业的快速发展，近年来，中国的饲料也受到霉菌污染的严重挑战。自 2006 年以来，玉米等饲料原料价格普遍上涨，致使很多饲料企业及养殖户使用低质饲料原 料，加上近年来气候的变化，华北、东北地区降雨量增
4、加，进一步加重了饲料原料中真菌 毒素的污染。而由于饲料原料和配合饲料中多种真菌毒素同时存在，在食用油等产品及牛 奶中真菌毒素污染也比较严重。在世界许多地方，目前真菌毒素已构成重要的食品安全问 题。真菌毒素对人类和动物健康可产生严重的影响，这一认识导致了许多国家在近几十年 来制定了诸多有关食品和饲料中真菌毒素的法规，以保护人类的健康，并保障生产者和贸 易商的经济利益。随着全球经济一体化的进程，类似真菌毒素等涉及安全卫生项目的限量 标准，越来越多地被利用为贸易保护主义中非关税壁垒的重要手段。因此，为了保证食品 安全，保障消费者的健康，为了打破国外的技术壁垒，同时在合理有利的前提下，更多地 树立我国
5、的技术性壁垒，开展饲料中真菌毒素的检测并建立标准方法是有效的方法之一。 目前国内应用标准检测方法大多为仪器方法，所需仪器设备昂贵，不利于进行广泛推广， 并且限制了很多检测单位高效、广泛地开展检测工作。建立符合中国国情的快速检测方法 标准，具有检测快速、简便、灵敏、成本低等优点，为打开市场并占领市场提供了先决条2件。（三）限量标准、检测方法及研究现状（三）限量标准、检测方法及研究现状1、限量标准国际上，在 1966 年 WHO/FAO 率先规定了世界贸易流通食品中 AFB1的最高允许量， 其中明确规定国际贸易的谷类作物中 AFB1的含量必须在 15g/kg 以下，超过此标准含量的 产品将不能投放
6、于市场进行流通和食用。英国在 1933 年规定，供人类消费前需加工的进口 农产品中 AFB1含量必须低于 10g/kg，供人类消费的农产品 AFB1的含量低于 4g/kg。美 国在 1994 年重新将黄曲霉毒素的限量进行调整：用于饲养家禽、猪、牛、羊的花生谷物等 制品中黄曲霉毒素总量不得超过 100g/kg，饲养幼年产奶动物的饲料中黄曲霉毒素的总量 不超过 20g/kg；两年后，美国联邦政府再次规范了黄曲霉毒素食品相关的安全法律，使 其对食品或动物饲料中黄曲霉毒素的含量要求更为严格，它规定人类消费食品和奶牛饲料 中的黄曲霉毒素总含量必须低于 15g/kg，人类消费的牛奶中 AFB1含量要低于
7、0.5g/kg， 其他动物饲料中黄曲霉毒素的含量要低于 30g/kg。最为严格的规定为欧盟国家，国家要 求人类生活的食品消费品中 AFB1的含量均不能超过 2g/kg。我国目前对 AFB1的限量为特 殊性膳食食品中为 0.5g/kg，其他食品和饲料中 AFB1的限量依据不同来源而有所不同，饲 料详细标准见表 1。表 1 我国饲料中的 AFB1限量标准产品名称限量/(g/kg)玉米、花生饼（粕）、棉籽饼（粕）、菜籽饼（粕）50豆粕30仔猪配合饲料及浓缩饲料10生长肥育猪、种猪配合饲料及浓缩饲料20肉用仔鸡前期、雏鸡配合饲料及浓缩饲料10肉用仔鸡后期、生长鸡、产蛋鸡配合饲料及浓缩饲料20肉用仔鸭前
8、期、雏鸭配合饲料及浓缩饲料10肉用仔鸭后期、生长鸭、产蛋鸭配合饲料及浓缩饲料15鹌鹑配合饲料及浓缩饲料20奶牛精料补充料10肉牛精料补充料502、检测方法及研究现状真菌毒素的检测方法主要有两种，一是将色谱技术作为基础的物理化学检测方法，包 括高效液相色谱法（HPLC）和气相色谱法（GC）等，而薄层层析法（TLC）由于操作过 程太复杂，国际上近些年使用这种方法检测真菌毒素的情况越来越少；二是免疫化学检测 法，主要指免疫亲和柱法（IAC）以及酶联免疫吸附法（ELISA）等。GC 可同时检测多种真菌毒素且检测限较低，但仍存在标准曲线线性关系不理想、测 定时需要进行衍生化、上一次进样待测物品滞留、重复
9、进样变异系数大使得重现性较差等3一系列问题。HPLC 法虽可精确进行定性定量测定，但是样品前处理较为繁琐、仪器昂贵 而成本高，同时需要专门的技术操作人员，因而一般用于大型企业、科研院校和专业检测 机构的定量分析。ELISA 检测黄曲霉毒素，样品前处理步骤简单且可实现定量化，但这种 生物学方法，受环境因素影响大，所用抗体和酶特别容易发生变质，如今市场上的同一物 质试剂盒检测结果差异性较大，稳定性还有待提高。相比较而言，胶体金免疫层析法无需大型仪器、所需辅助试剂少、交叉反应率低、试 纸条易于保存且可单份测定，避免了分析步骤繁琐、成本高等缺点，而且因其检测更快速、 操作更简单，测试人员无需进行专业培
10、训，所以更适合食品安全快速检测行业的快速检验 和基层检测，尤其是野外和偏远地区人员现场应用此项技术十分方便。（四）制定标准的必要性和意义（四）制定标准的必要性和意义1、提高农产品质量的需要黄曲霉毒素 B1是由产毒真菌产生的代谢物，广泛存在于粮油食品和饲料中。这些产毒 真菌分布于各级食物链，即使是在现今拥有先进的农业技术和食品加工工艺的条件下，在 作物种植、收获、储藏和加工过程中，仍然无法避免和防止产毒真菌的危害。随着我国经 济快速发展，人民群众物质文化生活水平不断提高，对食品安全的关注进一步提高，迫切 需要相应的检测技术，鉴于传统检测方法的专业性要求高和成本昂贵的缺点，黄曲霉毒素 B1快速检测
11、技术的研究及制订相应的检测方法标准是非常必要的。2、实现以人为本，保证广大群众生命健康的需要黄曲霉毒素 B1毒性很高，可通过污染谷物和那些来源于被黄曲霉毒素 B1污染了的饲 料喂饲的动物性食物（如牛奶、肉和蛋）而进入食物链，危害人类健康。其具有致突变、 致癌性，还具有免疫毒性，其作用的靶器官主要为肝脏，可引起人类和动物的肝脏病变和 致癌。为了对国家、人民高度负责，保障人民生命安全和农村社会稳定，研究黄曲霉毒素 B1快速检测技术并制订相应的检测方法标准是非常必要的。3、适应市场经济和加入 WTO 新形势的需要我国已经加入 WTO，我国农产品已面临国际和国内两个市场，为我国农产品（劳动密 集型）进
12、入国际市场提供了很好的机遇，但国际上十分重视农产品的安全问题，而农产品 易于被真菌污染，可能存在黄曲霉毒素 B1等真菌毒素残留问题，这已成为影响出口创汇的 最大制约因素。由于毒素残留超标，引起外国拒收，退货、扣留、索赔、撤消合同等事件 经常发生，给我国农产品生产者造成很大损失，并影响了我国农产品的形象。为了从源头 保证农产品质量，提高我国农产品的竞争力，研究黄曲霉毒素 B1快速检测技术并制订相应 的检测方法标准是非常必要的。二、标准制定过程二、标准制定过程饲料原料中黄曲霉毒素 B1的快速筛查 胶体金免疫层析法标准由江西省兽药饲料 监察所、北京勤邦生物技术有限公司、双胞胎（集团）股份有限公司、江
13、西正邦科技股份 有限公司负责起草编写。根据国家有关标准制定和修订工作的要求，标准起草单位在饲 料原料中黄曲霉毒素 B1的快速筛查 胶体金免疫层析法的起草编制过程中，主要工作包 括以下几个方面：（1）详细查阅了国内、国外有关标准和相关专业期刊上发表过的参考文献等技术资料，4并对这些资料进行了详细的对比，从方法的先进性、可靠性和实用性等几个方面考虑，选 取了几个代表性的参考资料作为标准起草中的主要技术参考文本。（2）及时购置相关的实验试剂、标准品和其他材料；已将 AFB1与丙二胺反应得到具 有氨基官能团的半抗原；将 AFB1半抗原与牛血清白蛋白和卵清蛋白分别进行偶联得到免 疫原和包被原；已将制备获
14、得的抗原通过免疫小鼠获得 AFB1单克隆抗体；建立了胶体金 免疫层析法的反应体系，摸索不同条件对方法进行最优化，最终确定了最佳的检测方法。（3）开展多种饲料原料胶体金快速检测方法的试验，包括小麦、大米、黄豆、玉米、 豆粕、花生粕、DDGS，这是方法的重要步骤和关键环节。不同样品用同一种方法进行试 验和验证，确保本检测方法能够灵敏、特异、准确地检测出饲料原料中 AFB1的含量。如： 方法的灵敏度，按照空白饲料原料样品及 2g/kg、5g/kg、10g/kg、20g/kg 四种浓度对 饲料原料进行添加，确定检测限；方法的准确率，通过对经验证的阴阳性样品进行检测， 得到本检测方法的假阴性率和假阳性率
15、，盲样测定与仪器方法的结果进行比对，确保本方 法的检测结果可靠；方法的特异性，运用本方法对饲料原料中常见的其他真菌毒素进行检 测，确保本方法能特异性地检测饲料原料中 AFB1残留。（4）在技术指标完成试验工作之后，严格按照标准的格式，起草编写标准文本内容和 编制说明内容。三、标准制定依据三、标准制定依据本标准是根据 GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写 、GB/T 20001.4-2015标准编写规则 第 4 部分：试验方法标准的要求而进行编写的。有 关技术内容是在参考国外有关标准及文献的基础上经研究、改进和验证后制定的。四、标准技术内容和技术指标的论证四、
16、标准技术内容和技术指标的论证（一）技术原理（一）技术原理本方法应用了竞争抑制免疫层析原理。将氯金酸用还原法制成一定直径的金溶胶颗粒， 标记抗体。硝酸纤维素膜为载体，利用了微孔膜的毛细管作用，滴加在膜条一端的液体慢 慢向另一端渗移。在移动的过程中，会发生相应的抗原抗体反应，并通过免疫金的颜色而 显示出来。样本中的黄曲霉毒素 B1在流动的过程中与胶体金标记的特异性抗体结合，抑制 了抗体和硝酸纤维素（NC）膜检测线上黄曲霉毒素 B1-BSA 偶联物的结合，使检测线不显 颜色，结果为阳牲；反之，检测线显红色，结果为阴性。（二）胶体金免疫方法主要材料的制备（二）胶体金免疫方法主要材料的制备1、半抗原的合成及鉴定AFB1为小分子物质，不具备免疫原性，只有反应原性，因此需要与大分子共价结合后 才能使动物免疫系统识别，产生相应的抗体，本实验首先需要合成小分子半抗原与蛋白质 偶联的人工抗原。AFB1小分子半抗原的制备既要保留其基本结构特征，同时又要很好地与大分子蛋白结 合。本项目通过 AFB1小分子结构改造获得具有氨基官能团的
